量子点双色探针检测胃腺癌中EGFR和p53的共表达

周玮玮,王 磊,王秋桐

(1.沧州市中心医院,河北 沧州061001；2.沧州医学高等专科学校)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，每年全球发病超过100万例， 我国是胃癌高发国家，新发及死亡病例约占全球的40%。胃腺癌是胃癌中最常见的类型，其发生率占胃恶性肿瘤的95%。QDs法具有荧光强度高、灵敏度高、荧光稳定性好等独特的光学性质[1-3]，可耐受反复的激发和长时间的观察，更重要的是其具有吸收光谱宽而连续、发射光谱狭窄且对称的特点，在同一激发光照射下，可进行一元激发、多元发射的同时标记，即可实现对多种肿瘤特异性标志物同时检测[4-6]，为寻找多因子表达作为判断癌症生物学行为及预后的参考指标，国内外学者进行了相关研究工作。Liu等[7]利用量子点对乳腺癌细胞的HER2水平和肿瘤间质中的Ⅳ型胶原蛋白实现了双色成像。He S等[8]发展了一种基于石墨烯纳米材料与DNA生物分子结合的多色探针，对同一溶液中多种 DNA 靶向分子进行了快速、灵敏、高选择性的同时检测。唐甜等[9]采用量子点免疫组化法检测了Bcl-2和p53 在血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中的表达。Chen H等[10]运用量子点免疫组化技术检测肺癌组织芯片中的caveolin-1和PCNA，检测结果更是优于传统的免疫组化。向清明等[11]利用量子点双标探针定量分析HER-2和Ki-67在乳腺癌中的协同表达，发现Ki-67对乳腺癌预后不良的影响权重约为HER-2的3倍。我们利用QDs作为示踪物同时标示EGFR、p53两种抗体，检测胃腺癌组织样本中的EGFR、p53突变抗原的表达，探讨QDs应用于胃腺癌组织中EGFR、p53同时检测的临床意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

光学显微镜(OLYMPUS)；正置荧光显微镜(BX51，OLYMPUS)；多光谱成像系统(Nuance Fx，CRI)。

单克隆鼠抗人EGFR抗体(1∶200，Origene公司)；单克隆兔抗人p53抗体(1∶200，Origene公司)；生物素化羊抗鼠IgG(1∶300，Origene公司)；量子点标记的链霉亲合素QDs-SA-525(1∶50，武汉珈源量子点公司)；量子点标记的羊抗兔IgG-605 (1∶50，武汉珈源量子点公司)。

1.2 方法

1.2.1胃癌组织样本收集 收集本院2015年1月-2016年6月胃癌组织标本78例，所有标本均由10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后保存，实验前进行4 μm连续切片，切片置于切片架上，于60 ℃恒温烤箱中过夜，备用。

1.2.2HE染色 对标本逐一HE染色后，结合病历资料和判定标准，对肿瘤进行分期和分级。

1.2.3组织标本QDs荧光双色标记 (1)切片脱蜡：将切片依次置于3个二甲苯缸中浸泡脱蜡，分别在梯度乙醇(100%、95%、85%)中依次浸泡10 min脱苯。(2)水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇 5 min，95%乙醇 2次(每次2 min)，85%乙醇2 min；75%乙醇 2 min，自来水冲洗，ddH2O洗 2×2 min。(3)抗原修复：采用高压修复法(EDTA， pH9.0)，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O洗 2×2 min，PBS 洗涤(2×2 min)。(4) 加一抗：滴加已稀释的一抗(鼠抗人EGFR抗体、兔抗人p53抗体)混合液，置于湿盒37℃温箱中孵育2 h，PBS-T洗涤(3×5 min)。(5)加生物素化二抗：加入已稀释的生物素化羊抗鼠IgG，置于湿盒37℃温箱中孵育30 min，PBS-T洗涤(3×5 min)。(6)荧光标记：滴加已稀释的QDs-SA-525和量子点标记的羊抗兔IgG-605，37 ℃湿盒中孵育60 min，PBS-T洗涤(3×5 min)。(7)观察成像：待组织标本干后，用缓冲甘油封片。用荧光显微镜在紫外光激发下观察成像。

2 结果

2.1 胃腺癌组织的形态学观察

经镜下形态学观察，肿瘤细胞呈乳头样、腺样及实性片状排列，或(和)单个生长弥漫性分布，根据癌细胞的异性及分化程度分为高、中、低三个等级。QDs标记后在蓝光激发下，p53出现红色荧光信号为阳性，出现在细胞核；EGFR出现绿色荧光信号为阳性，出现在细胞膜。

2.2 QDs探针检测EGFR、p53表达

78例胃癌组织标本参照TNM国际分期标准，根据肿瘤大小、浸润情况及淋巴结与远隔器官转移情况进行分期。其中，T1、T2、T3、T4分别为9例、3例、16例，50例，N0、N1、N2、N3分别为27例、16例、27例，8例；根据镜下形态学组织分化程度分级，高、中、低分化分别为0例、21例、57例。根据QDs标记后激发产生荧光情况，对组织标本中表达的强度和密度进行综合判断，按照阳性表达的强弱程度分为0、1+、2+和3+四等。QDs标记的78例胃癌组织中，EGFR阳性65例，占83.3%，其中强阳性(3+)41例，占52.6%；p53阳性54例，占69.2%，其中强阳性(3+)44例，占56.4%。结果利用SPSS19.0软件进行统计分析(见表1、表2)。

表1 EGFR、p53表达与胃腺癌病理特征的关系

所有因素的EGFR和p53(强)阳性表达经卡方检验计算P值。其中，两种因子(强)阳性率均为女性高于男性，特别是EGFR(强)阳性率，女性明显高于男性。年龄、性别因素中，所有P值均>0.05，即差异无统计学意义。T分期中，EGFR和p53两种因子阳性率均在T2分期最高，T3分期阳性率最低。所有P值均>0.05，即差异无统计学意义。N分期中，EGFR因子(强)阳性率均在N1分期最高，其次是N3分期，其中强阳性率P=0.038(<0.05)，差异有统计学意义；p53因子阳性率在N2分期最高，P=0.014(<0.05)，差异有统计学意义，强阳性率在N3分期最高，P=0.025(<0.05)，差异有统计学意义。组织分化程度分级中，所有样本均无高分化，p53强阳性率在低分化中最高，为61.4%，且P=0.024(<0.05)，差异有统计学意义。

表2 EGFR和p53共表达与胃腺癌临床病理特征的关系

所有因素的EGFR和p53(强)阳性共表达经卡方检验计算P值。性别因素中，两种因子强阳性共表达，女性明显高于男性，且P值<0.05，即差异有统计学意义。年龄因素中，P值>0.05，即差异无统计学意义。T分期中，两种因子阳性表达均在T2分期最高，所有P值均>0.05，即差异无统计学意义。N分期中，两种因子(强)阳性表达均在N2分期最高，其中强阳性率P=0.025(<0.05)，差异有统计学意义。组织分化程度分级中，p53(强)阳性表达在低分化中最高，P均>0.05，差异无统计学意义。

3 讨论

癌症的发生发展往往不只与单一肿瘤标志物表达有关，对于癌症的早期诊断来说，单独检测某一种肿瘤特异性标志物可能会产生“假阳性”结果。因此，发展简单有效的方法对多种肿瘤特异性标志物进行同时检测，可以为癌症诊断提供全面而可靠的信息，对于癌症的早期诊断及预后有非常重要的意义。QDs是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的大小在1-100 nm之间稳定的微小晶粒，由于纳米材料的尺寸效应和量子限域效应，其具有独特的荧光性能。在QDs合成过程中，通过控制合成时间、温度等条件，可制备不同粒径大小的QDs,基于QDs吸收光谱宽而连续，发射光谱狭窄且对称的光学特性，其在同一光源下受激发可产生不同颜色的荧光，将多色QDs标记在不同肿瘤标志物分子信标末端，成为多种抗原的QDs荧光探针，经与相应抗原特异性结合后，去除未结合的QDs探针，受激发产生不同颜色荧光信号，即可实现对多种肿瘤标志物的同时定量检测。实验用QDs实现了对胃腺癌组织样本中EGFR和p53的原位标记，得到了清晰的双色图像。

p53是重要的肿瘤抑制因子，在细胞周期的调控、细胞凋亡和肿瘤形成及发展中具有十分重要的作用。EGFR参与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡抑制等基因调控，在多种肿瘤组织中有高表达，在胃癌中的高表达与胃癌的发生、发展及生物学行为密切相关，被认为是胃癌治疗的理想靶点，目前已经成为胃癌生物治疗新的研究热点。p53和EGFR在胃腺癌中的研究国内外鲜有相关报道。本研究利用QDs探针标记成像并对结果统计分析，实验结果发现胃腺癌组织标本中的EGFR阳性率占83.3%， p53阳性占69.2%。p53因子阳性表达与淋巴结转移显著相关(P<0.05)；EGFR与p53因子强阳性表达均与淋巴结转移显著相关(P<0.05)；所有组织样本中，未见高分化样本，p53强阳性表达与分化程度显著相关(P<0.05)。两种因子共表达与胃腺癌临床病理特征的关系的分析中，两种因子强阳性表达仅与淋巴结转移显著相关(P<0.05)，与性别、年龄、浸润程度和分化程度均无关。

随着QDs探针在多色成像中的进一步应用，对细胞内多种特异性标志物的原位成像研究逐渐成为研究热点[12-15]，以求揭示其在肿瘤侵袭过程中的作用机制。另外，Chunying W等[16]报道了通过QDs标记试条快速同步定量检测甲胎蛋白和癌胚抗原，为实现多种肿瘤标志物的同步检测提供了捷径。QDs技术有助于定量分析p53和EGFR在胃腺癌中的协同表达，但由于研究报道较少，本组实验标本数量有限，有待于后续大样本研究进一步验证p53和EGFR在胃腺癌中的应用价值。

参考文献：

[1]Alivisatos A P.Semiconductor clusters,nanocrystals,andquantum dots[J].Science,1996,271:933.

[2]Chan W C,Maxwell D J,Gao X,et al.Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging[J].Curr Opin Biotechnol,2002,13(1):40.

[3]Gao X,Yang L,Petros J A,et al.Invivo molecular and cellular imaging with quantum dots[J].Curr Opin Biotechnol,2005,16(1):63.

[4]Sun B Q,Xie W Z,Yi G S,et al.Microminiaturized im-munoassays using quantum dots as fluorescent label by laser confocal scanning fluorescence detection[J].Journal of Immunological Methods,2001,249(1-2):85.

[5]Yang X Q,Chen C,Peng C W,et al.Quantrm dot-based quantitative immunofluorescence detection and spectrum analysis of epidermal growth factor receptorin breast cancer tissue arrays[J].Int J Nanomedicine,2011,6:2265.

[6]陈洪雷,朱小波,李蓓芸,等.利用量子点免疫荧光双标法在石蜡包埋组织中进行抗原的检测[J],中华病理学杂志,2009,38(6)：420.

[7]Liu X L,Peng C W,Chen C,et al.Quantum dots-based double-color imaging of HER2 positive breast cancer invasion[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,409(3):577.

[8]He S,Song B,Li D,et al.A graphene nanoprobe for rapid,sensitive,and multicolor fluorescent DNA analysis[J].Advanced Functional Materials.2010,20,(3):453.

[9]唐 甜，张端莲.应用量子点技术检测Bcl-2和p53在皮肤血管瘤中的表达[J].华中科技大学学报(医学版)，2013，42(2)：176.

[10]Chen H,Xue J,Zhang Y,et al.Comparison of quantum dots immunofluorescence histochemistry and conventional immunohistochemistry for the detection of caveolin-1 and PCNA in the lung cancer tissue microarray[J].J Mol Histol,2009,40(4):261.

[11]向清明，王林伟，袁静萍，等.量子点标记双分子探针技术观察乳腺癌HER-2与 Ki-67协同表达[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(4):464.

[12]Chen C,Xia H S,Gong Y P,et al.The quantitative detection of total HER2 load by quantum dots and the identification of a new subtype of breast cancer with different 5-year prognosis[J].Biomaterials,2010,31(33):8818.

[13]Liu X L,Peng C W,Chen C,et al.Quantum dots-based double-color imaging of HER2 positive breast cancer invasion[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,409(3):577.

[14]Peng C W,Liu X L,Chen C,et al.Patterns of cancer invasion revealed by QDs-based quantitative multiplexed imaging of tumor microenvironment[J].Biomaterials,2011,32(11):2907.

[15]Fang M,Yuan J P,Peng C W,et al.Quantum dots-based in situ molecular imaging of dynamic changes of collagen IV during cancer invasion[J].Biomaterials,2013,34(34):8708.

[16]Wang C Y,Hou F,Ma Y C.Simultaneous quantitative detection of multiple tumor markers with a rapid and sensitive multicolor quantum dots based immunochromatographic test strip[J].Biosensors and Bioelectronics,2015,68(15):156.