基于DNA条形码技术的防风药材市场调查研究

罗丹丹，方海兰，李 杨，段宝忠

（大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

防风为常用中药，来源于伞形科防风属植物防风 Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的根，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉功效〔1〕。各地常将川防风Ligusticum brachylobum Franch.、竹叶防风Seseli mairei H.Wolff、松叶防风S.yunnanense Franch.以及同科多种植物如杏叶防风Pimpinella candolleana Wight&Arn.、石 防 风 Peucedanum terebinthaceum（Fisch.ex Trevir.）Ledeb.、葛缕子 Carum carvi L.等作为防风混伪品使用〔2-5〕，由于这些药材均来源于伞形科，其根部特征与防风较为相似，采用传统的性状和显微鉴别等方法难以鉴别〔6-8〕，对临床用药安全造成极大威胁。

DNA条形码（DNA barcoding）技术是分子鉴定的最新发展，即通过比较一段通用DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定〔9〕。陈士林等对大量样本的研究表明，ITS2序列是鉴定药用植物及其混伪品的理想条形码〔10〕。该技术已广泛用于重楼〔11〕、臭牡丹〔12〕、艾叶〔13〕、何首乌〔14〕等多种中药材的混伪品鉴别研究，并取得了良好的效果。目前已有学者采用ITS2条形码对防风及其伪品中华前胡和杏叶防风等开展了鉴别研究，结果表明DNA条形码技术可有效鉴别防风及其混伪品〔15〕，但未见该技术用于竹叶防风、松叶防风等常见伪品的分子鉴别研究。鉴于此，本研究在建立防风及其常见混伪品的参照DNA条形码数据库的基础上，对来源于市场的28批标签为防风的药材进行了研究，以期为DNA条形码技术在药品检验和市场监管领域的应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器PCR仪（2720，Applied Biosystems，USA）；1-14K型高速冷冻离心机（Sigma公司）；植物组织研磨仪（Retsch MM400）；NanoDrop 2000∕2000C分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司）；各种量程的微量移液器（Eppendorf）。

1.2 材料本研究采集包括防风Saposhnikovia divaricata、竹叶防风Seseli mairei、杏叶防风Pimpinella candolleana及华山前胡Peucedanum ledebourielloides等4个物种8份植物样本，经大理大学段宝忠副教授鉴定，并从GenBank下载防风常见伪品的ITS2序列16条，含上述8个物种共24条ITS2序列用于构建防风及其混伪品的标准条形码数据库。见表1。28批标签为防风的药材（HSM-01～28）收集于市场或委托药商购于市场，其基原不详。见表2。

表1 防风及其习用品ITS2序列信息表

表2 市场收集药材样品表

2 方法

2.1 DNA提取植物样本叶片采用硅胶进行干燥，取30 mg，市场购买药材切碎，取40 mg。用植物组织研磨仪（Retsch MM400，Germany）研磨2 min。总DNA提取在植物组织提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）的操作规程基础上进行了改进。研磨后，使用核分离缓冲液（100 mmol∕L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol∕L EDTA，pH 8.0；0.3 mmol∕L NaCl；2%PVP40；2%β-巯基乙醇）抽提2次；水浴温度为54℃，水浴时间6 h；水浴后，使用氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次。其他操作均按试剂盒规程。

2.2 PCR扩增及测序ITS2序列的反应条件，扩增引物，以及扩增程序参照文献进行〔16〕。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，有条带的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。

2.3 数据处理所得的测序峰图利用CodonCode Aligner Version 5.1.5（CodonCode Co.，USA）进行组装拼接。基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法将所得序列及GenBank序列，除去5.8S和28S区，获得ITS2序列。采用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）构 建 NJ（Neighbor-Joining）树，Kimura 2-Parameter（K2P）法计算遗传距离。

3 结果

3.1 DNA提取与PCR扩增效率PCR扩增效率及测序成功率是评价DNA条形码序列的两个重要指标。本研究中，所提取的36份样品DNA（包括8份植物样本和28份药材样本），经NanoDrop 2000测定，A260∕A280值为1.8 ～ 2.0之间，样品DNA浓度为100～300 ng∕μL。表明改进后的提取方法所提取的DNA质量较好。PCR扩增效率及测序成功率均为100%。

3.2 参考样本ITS2序列遗传距离用于构建标准数据库的24条ITS2序列（8条植物样本序列，16条GenBank下载序列）长度范围为221～229 bp，GC含量为51.80%～59.26%。防风种内5个样本间的K2P遗传距离为0.000，防风与其他物种间的K2P距离范围为0.037～0.307。防风种内遗传距离小于种间遗传距离，表明ITS2序列可用于防风及其混伪品的鉴别。

3.3 市场药材鉴定分析将28批标签为防风的药材（编号HSM-01～28），分别在NCBI数据库（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）、中药材DNA条形码鉴定系统（TCM-DBS，http：∕∕.tcmbarcode.cn∕china∕）进行相似性搜索，DNA条形码比对结果见表3。从表3可看出，28批药材样品分属于5个物种，其中有10份药材为防风，占35.71%；8份与竹叶防风具有高度相似性，占28.57%；6份与华山前胡相似，占21.43%；3份与杏叶防风相似，占10.71%；1份为伞形科其他物种。

表3 市售标签为防风的药材BLAST及TCM-DBS鉴定结果

3.4 市场药材NJ树分析将市场28个药材样品的ITS2序列与24条参考DNA条形码，构建NJ树。见图1。从图1可看出，样品HSM-02～04、06～12与正品防风S.divaricata聚为一支；样品HSM-01、05、20～24、26与竹叶防风 S.mairei聚为一支；样品HSM-13～18与华山前胡 P.ledebourielloides聚为一支；样品HSM-19和HSM-27～28与杏叶防风P.candolleana聚为一支。仅HSM-25未与参考序列库内的物种聚为一支，BLAST结果为白花前胡P.praeruptorum或红前胡P.rubricaule。

4 讨论与结论

药材基原物种的准确鉴定是避免混伪品混淆使用的关键。传统的性状和显微鉴定方法主要依靠形态特征进行鉴定，这类方法主观性强，同时对鉴定者的专业水平要求高。随着当前传统鉴定专业人才的匮乏，药材外观相似或同物异名对市场药材监管部门提出了挑战。DNA条形码是一种分子鉴定技术，其不受环境因素、样品形态和材料部位的限制，已成为中药原植物和药材鉴定的有效手段〔9〕，其操作简单，可实现鉴定结果的客观和自动化，有效缓解了中药材鉴定人才缺乏的现状。

图1 基于ITS2序列构建的防风市场药材NJ树

本研究采用ITS2条形码鉴定防风常见混伪品〔17-18〕，建立了防风及其混伪品的参考DNA标准条形码数据库，并利用该数据库对市场收集的28批标签为“防风”的药材进行了鉴定和验证。结果表明ITS2序列可有效鉴别已知混伪品。DNA鉴定结果表明，市售防风药材来源复杂，在调查的28批防风药材中，仅有10批为正品防风S.divaricata，其余药材植物基原可能有竹叶防风S.mairei，华山前胡P.ledebourielloides，白花前胡P.praeruptorum、杏叶防风P.candolleana等多种，这些药材性味功效与防风差异较大〔19〕，对防风临床用药的安全和有效造成了极大威胁。上述DNA条形码的鉴定结果与前人的研究结果基本一致〔3〕，表明DNA条形码可作为中草药来源鉴定和市场混伪品检测的有效工具。

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