大豆抗原蛋白对仔猪的免疫作用

张　瑜，王元红，汤雪冰，彭成璐，舒迎霜，曹程鸣，冯士彬，李　玉，王希春，吴金节

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

大豆作为优质的植物蛋白源，一直被广泛应用于畜禽饲粮。然而大豆及其制品中存在的一些抗营养因子，如大豆凝集素、大豆抗原蛋白、胰酶抑制因子等，会影响动物机体对营养成分的吸收。这些抗营养因子使得幼畜出现肠道过敏反应，导致肠道形态损伤、免疫功能紊乱、生长抑制和腹泻，甚至死亡等[1-4]。

研究表明，大豆抗原蛋白是大豆中的主要致敏因子。依据蛋白质沉降系数，可将大豆抗原蛋白分为2S、7S、11S等，其中β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)是主要致敏原[5]。业已证实，豆粕发酵和大豆膨化等多种方法能降低大豆制品的抗原活性，但因大豆抗原蛋白热稳定性高，目前市面上的方法依然不能使之充分灭活[6]。为了使大豆及其制品能更充分、安全、有效地得到利用，降低或消除其致敏性，国内外研究人员对其免疫原性和致敏原性进行了很多研究：一方面，使用物理、化学、遗传育种等技术，寻找降低或者消除大豆抗原蛋白的方法[7-8]；另一方面，研究者从大豆抗原蛋白对动物机体的生产性能、免疫功能、肠道功能的影响入手[9]，深入探索大豆抗原蛋白对动物机体的致敏机理。

在前期研究的基础上，本研究应用纯化的7S及11S制备成免疫剂，采用口服及注射两种免疫方法深入探索大豆抗原蛋白的致敏原性与免疫原性，通过检测仔猪血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平和抗体效价及皮肤致敏反应，研究大豆抗原蛋白对仔猪的免疫效果及作用机制，以期为大豆及其产品的安全使用提供新的途径。

1　材料与方法

1.1　试验材料与试验动物

大豆抗原蛋白7S和11S由中国农业大学食品工程学院提供，再次纯化后7S纯度为92.3%、11S纯度为93.1%。“杜×长×大”三元杂交仔猪，由安徽省青阳县五星养殖有限公司提供。冷冻高速离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2　大豆抗原蛋白免疫剂的制备和检测

佐剂的准备。弗氏佐剂，包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。

乳化抗原蛋白。在1.5 mL的EP管中，加入0.5 mL的11S抗原液或7S抗原液和0.5 mL的佐剂(第一次免疫剂用弗氏完全佐剂，第二次免疫剂用弗氏不完全佐剂)，先用涡旋机混匀，再进行超声混匀。乳化后取一滴在清水里，观察是否分散，不分散即乳化完全，分散则继续乳化。乳化完成后，4 ℃冷藏保存。制备的11S免疫剂或7S免疫剂，经培养基无菌检验和肌肉注射刺激家兔腿部肌肉证明安全且无刺激反应。

1.3　试验分组

本试验采用随机分组设计：对照组(A组)，7S致敏组(B组)，11S致敏组(C组)，7S口服免疫+致敏组(D组)，11S口服免疫+致敏组(E组)，7S注射免疫+致敏组(F组)，11S注射免疫+致敏组(G组)。选取70头7日龄体重相近、健康状况良好的“杜×长×大”三元杂交仔猪进行试验，分成7组，每组10头。仔猪在7日龄时，A组注射生理盐水，D、F组和E、G组按分组设计以1 mg·kg-1体重的剂量口服或注射纯化的7S免疫剂或11S免疫剂，在14日龄时，按以上方法再免疫一次。在27日龄时，对仔猪进行皮肤致敏试验。所有仔猪于21日龄断奶。从21日龄开始，对照组仔猪饲喂基础日粮(仔猪代乳料，不含大豆或大豆制品)，B、D、F组和C、E、G组仔猪分别饲喂添加5%的7S或11S的基础日粮，连续饲喂7 d。分别在7、14、21和27日龄，每天上午7:00—8:00，仔猪前腔静脉采血，样品于室温静置2～3 h，600g离心10 min，分离血清，-20 ℃保存备用。

1.4　饲养管理

试验仔猪采用全封闭饲养管理，自由饮水和采食，消毒免疫程序均按照猪场管理常规标准执行。从7日龄开始，对全部试验仔猪饲喂仔猪代乳料，直至21日龄。

1.5　大豆抗原蛋白的皮肤致敏试验

在27日龄时，每组随机选择4头仔猪，麻醉后，确定无针刺反应，用记号笔在仔猪腹部剃毛皮肤上划分出3个皮试区域，分别在相应区域皮内注射生理盐水或浓度为5 mg·mL-1的11S或7S蛋白溶液0.1 mL，30 min后，观察并记录皮肤反应情况。根据红斑直径大小来判断：1级，未见红斑，记为“-”；2级，红斑直径1～5 mm，记为“±”；3级，红斑直径5～10 mm，记为“+”；4级，红斑直径10～20 mm，记为“++”；5级，红斑直径>20 mm，记为“+++”。

1.6　琼脂扩散法测定抗体效价

取7、14、21、27日龄仔猪的血清，以纯化后的7S和11S作为抗原，使用打孔器，在1%琼脂平板的中央打一个孔，围绕中央再打6个孔，在中间孔内加入纯化的7S或11S，浓度为1 mg·mL-1，周围的6个孔分别加入1∶1、1∶2、1∶4、1∶16、1∶32、1∶64的抗血清，滴满不溢出即可，37 ℃的温箱中孵育24 h。当抗原抗体浓度之比相适宜时，能形成一白色弧状沉淀线，然后观察沉淀线，确定抗体效价。

1.7　仔猪血清样品采集与血清中IgA、IgM、IgE、IgG和 IL-4水平的测定

取7、14、21、27日龄仔猪的血清，按照ELISA试剂盒说明书中的方法测定血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平。

1.8　数据处理

试验数据采用平均数±标准差的形式表示，采用SPSS软件中的ANOVA过程对试验数据进行方差分析，对有显著差异的处理采用LSD法进行多重比较。

2　结果与分析

2.1　大豆抗原蛋白免疫剂安全性检测结果

大豆抗原蛋白免疫剂接种培养基无细菌生长，注射家兔肌肉无充血现象，说明11S免疫剂和7S免疫剂有较高安全性。

2.2　大豆抗原蛋白皮肤致敏试验

皮肤致敏30 min后，所有仔猪皮肤生理盐水注射点的结果基本显示“-”，A组7S和11S蛋白注射点的结果也基本上显示为“-”，即致敏反应不明显，B、C组基本在“+”级以上，且7S蛋白注射点的评判结果达到了“++”级以上，表示仔猪出现过敏反应，D、E组基本为“++”级以下，F、G组基本为“+”级以下(表1)。以上结果说明，免疫后再致敏能对仔猪产生一定的保护作用。

表1大豆抗原蛋白对仔猪皮肤过敏分级计数结果

Table1Results of skin test reactions in piglets induced by soybean antigen protein

注射试剂Injectionreagent组别Group-±++++++生理盐水A组 GroupA40000PhysiologicalB组 GroupB31000salineC组 GroupC40000D组 GroupD40000E组 GroupE31000F组 GroupF40000G组 GroupG310007SA组 GroupA31000B组 GroupB00013D组 GroupD00130F组 GroupF0130011SA组 GroupA31000C组 GroupC00022E组 GroupE00220G组 GroupG01300

2.3　琼脂扩散法检测抗体效价

由表2可以看出，在21日龄，F、G组仔猪血清中抗体效价达1∶32，D、E组达1∶16。在27日龄时，B、C组仔猪血清中抗体效价水平高达1∶64，而D、E、F、G组为1∶32，说明11S和7S可以使仔猪发生致敏反应和免疫作用，血清中存在可检测的特异性大豆蛋白的抗体。

2.4　大豆抗原蛋白对仔猪血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平的影响

2.4.1仔猪血清中IgA水平的变化

如表3所示，在7日龄、14日龄和21日龄时，各组仔猪体内血清IgA的水平没有显著差异(P>0.05)。在27日龄时，B、C、D、E组显著(P<0.05)高于A、F、G组。

表2β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清中抗体效价的影响

Table2Effects of β-conglycinin and glycinin on serum antibody titers in piglets

组别Group7日龄7daysold14日龄14daysold21日龄21daysold27日龄27daysoldA组GroupA————B组GroupB———1∶64C组GroupC———1∶64D组GroupD—1∶41∶161∶32E组GroupE—1∶41∶161∶32F组GroupF—1∶161∶321∶32G组GroupG—1∶161∶321∶32

表3β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清IgA水平的影响

Table3Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgA levels in piglets

mg·mL-1

同列各处理间无相同大、小写字母的分别表示差异极显著(P<0.01)与显著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same uppercase or lowercase letters within the same column indicated significant difference atP<0.01 orP<0.05， respectively. The same as below.

2.4.2仔猪血清中IgM水平的变化

如表4所示，在仔猪7日龄和14日龄时，各组IgM水平没有显著差别(P>0.05)。在21日龄时，D、E、F、G组IgM水平与A、B、C组相比显著(P<0.05)升高，且F、G组IgM水平显著(P<0.05)高于D、E组。在27日龄时，各处理组IgM水平与A组相比均显著(P<0.05)增加，且B、C组IgM水平显著(P<0.05)高于D、E、F、G组。随时间推移，各组IgM水平整体呈现下降趋势。

2.4.3仔猪血清中IgE水平的变化

如表5所示，在7、14日龄时，各组仔猪体内血清IgE的水平没有显著差异(P>0.05)。在21日龄时，D、E、F、G组仔猪体内血清IgE的水平极显著(P<0.01)高于A、B、C组，F、G组显著(P<0.05)高于D、E组。在27日龄时，各处理组仔猪体内血清IgE的水平与A组相比均极显著(P<0.01)升高，其中，B组显著(P<0.05)高于C组，B、C组极显著(P<0.01)高于D、E、F、G组，D、E组与F、G组相比显著(P<0.05)升高。

2.4.4仔猪血清中IgG水平的变化

如表6所示，在仔猪7日龄时，各组IgG水平没有显著差异(P>0.05)。在14、21日龄时，F组与其他组相比IgG水平显著(P<0.05)增加。

表4β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清IgM水平的影响

Table4Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgM levels in piglets

mg·mL-1

表5β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清IgE水平的影响

Table5Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgE levels in piglets

mg·mL-1

表6β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清IgG水平的影响

Table6Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IgG levels in piglets

mg·mL-1

在27日龄时，与A组相比，其余各组IgG水平极显著(P<0.01)增加，B、C组显著(P<0.05)高于D、E、F、G组，D、E组又显著(P<0.05)高于F、G组，B组显著(P<0.05)高于C组。

2.4.5大豆抗原蛋白对仔猪血清中IL-4水平的影响

由表7可知，在仔猪7日龄时，各组IL-4水平没有明显差异(P>0.05)。在14日龄时，F、G组IL-4水平显著(P<0.05)高于其他各组。在21日龄时，D、E、F、G组IL-4水平极显著(P<0.01)高于其他组，F、G组显著(P<0.05)高于D、E组。在27日龄时，F、G组IL-4水平显著(P<0.05)高于A组，B、C组和D、E组极显著(P<0.01)高于A组，F、G组极显著(P<0.01)低于D、E组，B组显著(P<0.05)高于C组，D、E组与B组相比显著降低(P<0.05)，F、G组与B、C组相比极显著(P<0.01)降低。

表7β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白对仔猪血清IL-4水平的影响

Table7Effects of β-conglycinin and glycinin on serum IL-4 levels in piglets

mg·mL-1

3　讨论

本研究发现，大豆抗原蛋白致敏仔猪能显著提高血清中IgG、IgA、IgM、IgE，以及IL-4水平，且7S的致敏性高于11S。大豆抗原蛋白免疫剂对仔猪具有一定的免疫保护作用，其中，7S的免疫效果优于11S，注射免疫的效果优于相同剂量的口服免疫。

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白具有免疫原性，是引起动物肠道发生过敏反应的主要成分[2]。在本试验中，对照组的11S蛋白注射点、7S蛋白注射点的红斑直径大小与生理盐水注射点相似，说明不致敏的仔猪注射少量的11S和7S并不会引起仔猪发生过敏反应。而致敏组的评判结果均在“+”级或“+”级以上，其中，7S致敏组评判结果达到“++”级以上，说明7S的免疫原性比11S更强，这与Chen等[10]和徐述亮等[11]的结果一致。免疫致敏组相较于致敏组反应较轻，说明免疫后再致敏会降低过敏反应，有一定的免疫保护作用，这在抗体效价和血清学检测中也得到了证实。注射致敏组的反应轻于口服致敏组，这可能是因为通过注射途径进行免疫，可很快地被吸收循环到全身。而大豆抗原蛋白作为大分子物质，经口服途径免疫，不易被完整吸收，一些被酶消化分解后吸收，一些被排出体外，不能有效地发挥免疫保护作用。

研究表明，大豆抗原蛋白引起的过敏反应是多种免疫机制共同作用的结果。7S和11S进入机体后，主要引起由IgE介导的I型过敏反应、免疫复合物介导的Ⅲ型过敏反应，以及T淋巴细胞介导的IV型迟发性过敏反应[12-14]。本试验结果显示，在仔猪27日龄时，大豆抗原蛋白处理组IgG和IgE的抗体水平均有明显升高，且7S致敏组高于11S致敏组，说明IgG和IgE参与了过敏反应，且7S的免疫原性要高于11S，这与Wu等[15]、曹程鸣等[16]、Sun等[17]的研究结果相似。另外，Guo等[18]建立的以大鼠为试验动物的过敏反应模型也发现，血清中的IgE水平显著升高。经过免疫后再致敏的仔猪，其IgG的抗体水平明显低于致敏组，且注射致敏组要低于口服致敏组。这说明提前免疫能增强动物机体体液免疫能力，且注射免疫的效果明显要优于口服免疫。仔猪免疫后，体内IgA抗体水平没有明显差别，但致敏后IgA的抗体水平显著提高，IgM的抗体水平较对照组有明显上升，随着日龄的增加，整体呈现下降趋势。究其原因，可能是虽然初次应答产生的最早的抗体是IgM，且在几天内达到高峰，但随后便会快速下降，当机体再次应答时，会产生大量的IgG，从而减少了IgM 的分泌。

细胞因子在机体的免疫应答中起着非常重要的调节作用[8]。Lallès等[19]研究发现，给犊牛饲喂添加大豆抗原蛋白的日粮，能导致肠道损伤，Th2细胞可以分泌IL-4和IL-6等细胞因子，参与Ⅰ型过敏反应与炎症反应。李宝等[20]通过在日粮中添加不同剂量的7S和11S饲喂仔猪也得到了相似的结果，推测IL-4在I型过敏反应中起了重要作用。本试验中，口服或注射大豆抗原蛋白免疫剂，均可使仔猪血清中IL-4水平明显升高。致敏组仔猪与对照组相比，血清中IL-4的水平有极显著差异，与免疫后致敏组相比有显著差异，且7S组较11S组差异显著。此外，一些研究表明，IL-4对很多细胞都具有免疫调节作用。IL-4能增强B细胞的抗原提呈能力，小量的抗原刺激即会激发免疫应答。IL-4也能增强 IgG1和IgE水平，甚至可以与IL-3协同，刺激黏膜的肥大细胞生长[17，21]。这说明，IL-4在速发型过敏反应中发挥着重要作用，是炎症和免疫防御的主要参与者。

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