分子标记辅助选择改良杂交水稻组合丰两优香1号的白叶枯病抗性

梁发茂 王利润 徐俊英，李志新

( 长江大学农学院，湖北 荆州 434025)( 中国种子集团有限公司生命科学技术中心，湖北 武汉 430223)长江大学农学院，湖北 荆州 434025；主要粮食作物产业化湖北省

革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonasoryoryzaepv.oryzae, Xoo)引起的水稻白叶枯病( Bacterial Blight,BB)是影响世界水稻生产的最严重的细菌性病害之一，该病发生可导致水稻严重减产和品质下降。1884年日本福冈地区首发白叶枯病以来，其发病范围不断扩大。目前，包括亚洲主要产稻国在内，澳洲、非洲和美洲等地区也陆续发现白叶枯病。我国除新疆外，全国各地均有发生，成为我国仅次于稻瘟病的第二大病害。由于该病危害严重，且化学方法难以防治，培育抗病品种便成了克服白叶枯病最有效的途径[1]，水稻白叶枯病自发现以来，各国科学家投入大量精力研究，目前我国粳稻品种大多带有Xa3基因，粳稻品种大多携带Xa4，这2个抗性基因的应用成功地抑制了我国白叶枯病的大面积爆发。20世纪80年代，我国广东省出现了能侵染Xa4的Ⅴ型菌，并向其他周边省区扩展[2]。 2005年该病在我国苏、皖一带重新爆发[3]。我国稻区流行小种的监测表明，我国国内稻区病菌小种的组成基本稳定，目前流行的优势小种仍为CⅠ和CⅡ，但Ⅴ型菌的频率有所增加[4]。南方籼稻区以Ⅳ型为主，长江中下游籼、粳区以Ⅳ和Ⅱ型为主，北方粳稻区以Ⅰ和Ⅱ型居多[5]。

截止到2016年，经期刊报道和国际注册的白叶枯抗性基因已有40个[6]，其中5个显性基因Xa1[7]、Xa21[8]、Xa23[9]、Xa3/Xa26[10，11]和Xa27[12]，2个隐性基因xa5[13]和xa13[14]已被克隆。大量抗性基因的鉴定和克隆为分子标记辅助选择育种提供了基因资源，而利用分子标记辅助选择技术改良水稻恢复系的抗病性效果显著。Huang等[15]将白叶枯抗性基因Xa7、Xa21、Xa22和Xa23导入恢复系华恢1035中，显著提高水稻恢复系及其杂交组合白叶枯病抗性；杨丰宇等[16]利用分子标记辅助选择改良早籼稻1701的稻瘟病抗性。谭令辞等[17]利用Pi9基因分子标记辅助选择成功培育出抗稻瘟病水稻新品系，加快了作物育种中间材料的选育进程。楼珏等[18]聚合稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱抗性基因选育带有抗性基因且农艺性状良好的改良恢复系，为杂交稻抗病虫育种提供了理论依据。

丰两优香1号是合肥丰乐种业选育的优势杂交水稻，通过多省和国家审定，在长江中下游地区种植面积较大，且曾为湖北省中籼组对照品种，但由于该恢复系感白叶枯病，其应用推广受到一定限制。鉴于此，本研究利用携Xa7和Xa21的供体亲本R119(Xa7)和R161(Xa21)通过分子标记辅助选择、回交和聚合杂交相结合，改良三系恢复系丰香恢1号的白叶枯病抗性，构建了农艺性状与丰香恢1号相似的改良株系和聚合系，并对稳定改良株系及其所配杂交组合进行了抗性、产量和品质的评价。

1　材料与方法

1.1　水稻材料

Xa7、Xa21的基因供体亲本分别为R119和R161，为本研究组创建；受体材料丰香恢1号由合肥丰乐种业有限公司提供，感病对照IR24均由上海农业基因中心提供。

1.2　水稻白叶枯病菌系

本研究所用2个来自于菲律宾的菌株PXO61(P1)和PXO99(P6)由上海农业基因中心提供；3个来自于中国的Zhe173( C4)、FuJ(C8)和GD1358( C5)由湖北省宜昌市农业科学研究院提供，菌系划分见文献[19，20]。

1.3　试验方法

1.3.1单基因导入系和基因聚合系的构建

本研究以丰香恢1号为轮回亲本，分别用携有Xa7、Xa21基因的R119(Xa7)和R161(Xa21)为父本分别进行杂交和回交，构建各单基因的导入系。各回交世代利用分子标记辅助选择，采用人工接种鉴定，选择农艺性状与丰香恢1号相似的优良阳性单株继续回交，回交3代后，选择背景与丰香恢1号相似的株系自交3～4代，通过人工接种鉴定和分子标记选择目标基因纯合的稳定株系。

利用携有Xa7和Xa21的稳定株系复交和自交，F4代运用人工接种鉴定和分子标记选择背景与丰香恢1号相似的抗性优良的目标基因纯合的稳定株系为抗性基因聚合系。共计得到分别含有Xa7、Xa21、Xa7+Xa21的稳定株系各1个，命名排序为X01～X03。2016年7月，在长江大学农学院试验田对这3个稳定株系及其所配组合进行白叶枯病抗性鉴定和田间农艺性状考察等试验。

1.3.2白叶枯病抗性鉴定

表1　水稻白叶枯病抗性评价标准

2016年5月10日，3个改良株系及其所配组合、2个对照材料和IR24分别播种于长江大学农学院试验田，6月1日插秧，单本插，密度为16.7cm×20cm，每材料种植8株，设置7个重复，菌株培养参见Lin等方法[20]。分蘖盛期以5个菌系( PXO61、PXO99、Zhe173、GD1358、和FuJ)进行抗性鉴定，选取主茎剑叶平展叶片，用预先灭菌处理的、型号一致的平口剪刀沾取浓度约为3×108cfu/mL菌悬液，剪去叶尖2～3cm，每株接种3～4片叶，每区材料剪叶数大于30片[20]。接种后21d左右，当感病对照IR24病情稳定时，调查植株的抗性水平，抗性评价标准见表1。

1.3.3 改良株系及杂交组合的主要农艺性状及稻米品质分析

2016年5月10日，丰香恢1号及其改良株系X01～X03所配杂交组合种植于长江大学农学院试验田，每区材料分3行种植，每行10株，密度为16.7cm×20cm。9月成熟期，各区材料随机取5株进行室内农艺性状考察。考查的主要农艺性状包括全生育期、株高、单株有效穗数、平均穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率和千粒重等。

根据国家优质稻标准( GB/T17891-1999)测定方法，对改良株系、杂交组合及对照组合的稻米进行外观品质和蒸煮品质分析，包括糙米率、精米率、整精米率、垩白度、垩白粒率、糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量等。

1.4　抗性基因的分子标记选择

1.4.1DNA提取和标记选择

提取DNA参见楼巧君等[21]的简化CTAB法。其中，与Xa7基因紧密连锁的标记RM20582引物设计参见Chen等[22]，与Xa21基因紧密连锁的引物PTA248参见文献[23]。各标记的详细信息见表2。

表2　白叶枯抗性基因紧密连锁的分子标记和序列

1.4.1PCR扩增体系

20μL的扩增反应体系包含20ng模板DNA，2μL的10×buffer、1.8μL的2.5mmol/L MgCl2、1.8μL的2mmol/L dNTP、10μmol/L的正反引物各0.2μL，1.5U的Tag酶0.2μL，加灭菌的双蒸水至20μL，进行PCR扩增。反应程序为94℃下预变性5min，94℃ 30s、55℃ 30s (其中PTA248的退火温度为60℃)、72℃ 45s循环反应34次，72℃下延伸反应10min后于4℃保存，扩增产物在2.5%琼脂糖胶或4%聚丙烯酰胺( PAGE)凝胶电泳后用溴化乙腚( EB)或硝酸银染检测。

2　结果与分析

2.1　改良株系的构建及分子标记辅助选择

2011年夏在荆州用供体亲本R119(Xa7)和R161(Xa21)分别与丰香恢1号开始杂交，以后每年在荆州、海南进行2个世代的回交、聚合杂交和自交，至2016年春季，已经育成含有抗性基因的农艺性状稳定的改良株系3个，其中携带抗性基因Xa7、Xa21、Xa7+Xa21株系各1个。

利用2个与抗性基因紧密连锁的分子标记RM20582和PTA248，对供体亲本，受体亲本丰香恢1号及杂合基因型进行多态性分析，各连锁标记在亲本间均表现出良好的多态性，在杂合基因型中有明显共显性分离，说明这2个标记可用来鉴别后代群体的分离基因型。每一回交和自交世代中都运用分子标记辅助选择阳性基因型单株。最终获得稳定纯合的株系3个，命名排序为X01～X03。2016年夏季，在荆州对育成株系X01 (Xa7)和X02(Xa21)取10株进行分子检测，每个株系的PCR扩增带型与供体亲本一致( 图1～2)，说明改良株系均携带抗性基因，且目标基因已经稳定纯合。

M：2kb Marker；P1：受体亲本；P2：供体亲本；1～10：X02株系的单株图1　PTA248( Xa21)标记在X02改良株系的PCR扩增

M：2kb Marker；P1：供体亲本；P2：受体亲本；1～10：X01株系的单株图2　RM20582( Xa7)标记在X01改良株系的PCR扩增

2.2　亲本、改良株系及其杂交组合的白叶枯病的抗性评价

2016年7月，在水稻孕穗期用5个菌种对研究材料进行白叶枯病抗性鉴定，鉴定结果见表3。分析结果表明，感病材料IR24对7个菌系的抗性表现为感病或高感，平均病斑长度大于18cm，表明接菌反应趋于稳定，各菌株致病力正常。对照材料丰香恢1号对5个菌株均表现感病，病斑长度大于9cm。2个基因供体亲本的抗性反应如下：R119(Xa7)对菌株PXO99抗性反应为中感，对其他4个菌株都表现为高抗白叶枯病，平均病斑长度小于1cm；R161(Xa21)对菌株GD1358和FuJ表现为感病，在其他3个菌系中都表现为抗病反应，平均病斑长度小于5cm，表明不同抗性基因对不同生理小种的抗性反应不一致。携有Xa7基因改良株系X01(Xa7)对菌株PXO99表现感病，对其他4个菌株都表现为抗病，平均病斑长度小于3cm。携有Xa21基因的株系X02(Xa21)菌株FuJ表现感病，病斑长度15.88cm，对其他4个菌株表现中抗或高抗，平均病斑长度0.33～4.92cm。携有Xa7+Xa21基因的株系X03(Xa7+Xa21)对5个菌株均表现抗病，病斑长度为0.21～3.49cm，抗性水平明显高于单基因改良株系。对其他4个菌株表现中抗或高抗，平均病斑长度0.33～4.92cm。

表3　亲本、改良株系及杂交组合的白叶枯病的抗性评价( 2016,荆州)

注：HR-抗；R-抗；MR-中抗；HS-高感；S-感；MS-中感 。

改良株系与不育系广占63-4S配制的杂交组合的白叶枯病抗性鉴定表明，对照组合丰两优香1号对5个菌株均表现感病，病斑长度为8.59～22.8cm，杂交组合广占63-4S/X01(Xa7)对菌株PXO99表现感病，病斑长度为15.69cm，对其他4个菌株表现抗病，病斑长度为0.96～2.96cm；杂交组合广占63-4S/X02(Xa21)对菌株PXO99和FuJ表现感病，对其他2个菌株表现抗病，病斑长度为1.52～4.37cm；杂交组合广占63-4S/X03(Xa7+Xa21)对菌株PXO99表现感病，对其他4个菌株表现抗病，病斑长度为0.32～2.40cm，从抗性水平表现看，双基因聚合的杂交组合抗性明显提高，说明通过分子标记辅助选择技术，可以提高丰香恢1号及其杂交组合的抗性。

2.3　改良株系及其杂交组合主要农艺性状分析

成熟期对3个重复中各改良株系及其杂交组合选中间行5个单株测量株高、单株有效穗数、单穗长、结实率和千粒重等主要农艺性状进行考查，结果见表4。3个改良株系的生育期、单株有效穗数、平均穗长、千粒重与丰香恢1号无显著差异，改良株系X02(Xa21)株高显著高于丰香恢1号，每穗总粒数和每穗实粒数显著多于丰香恢1号；改良株系X03(Xa7+Xa21)每穗总粒数、每穗实粒数和结实率显著高于丰香恢1号。3个改良杂交组合与丰两优香1号在生育期和平均穗长性状无显著差异。组合广占63-4S/X01(Xa7)平均穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率和千粒重均低于丰两优香1号；组合广占63-4S/X02(Xa21)与丰两优香1号相比，各性状均无显著差异；组合广占63-4S/X03(Xa7+Xa21)株高显著低于丰两优香1号，每穗实粒数、每穗总粒数和结实率均高于丰两优香1号。分析结果表明，各改良株系经过多代回交后基本恢复了丰香恢1号的优良背景，在保持其优良性状不变的基础上大大提高了对白叶枯病的抗性，可以作为良好的育种材料加以利用。

表4　亲本、改良株系及其所配组合主要农艺性状比较( 2016，荆州)

注：*、**分别表示0.05和0.01显著水平。

2.4　改良株系及杂交组合的米质分析

3个改良株系及杂交组合的稻米品质分析结果( 表5)表明，3个改良株系的糙米率、精米率、整精米率、长宽比和直链淀粉含量与丰香恢1号基本一致，改良株系X01(Xa7)在垩白粒率和垩白度高于丰香恢1号，胶稠度降低，改良株系X02(Xa21)和X03(Xa7+Xa21)在垩白粒率和垩白度低于丰香恢1号。3个杂交组合的品质性状与改良株系基本一致，组合广占63-4S/X01(Xa7)的垩白粒率和垩白度高于丰两优香1号，组合广占63-4S/X03(Xa7+Xa21)的垩白粒率和垩白度低于丰两优香1号，直链淀粉含量稍高，胶稠度显著低于丰两优香1号。

表5　亲本、改良株系及杂交组合的稻米品质分析( 2016，荆州)

3　讨论

3.1　抗性基因的合理选择和利用

杂交稻恢复系白叶枯病改良利用中必须明确目标抗性基因的完全显性遗传，能在不同的遗传背景下完全表达。本研究结果显示，同一抗性基因在不同的遗传背景下表达是有差异的，丰香恢1号背景下的材料对白叶枯病的抗性水平优于IR24背景，研究发现同一基因在不同背景下对同一菌系的反应也有差异，R119(Xa7)与株系X01(Xa7)对菲律宾小种PXO99都表现感病，但改良株系的病斑长度明显大于R119(Xa7)，供体亲本R162(Xa21)对菌株GD1359和FuJ表现感病，而改良株系X02(Xa21)仅对菌株FuJ表现感病，抗性水平相对高于供体亲本。这也说明在抗性基因的选择和利用方面，应有目的地了解当地的优势小种。针对我国长江中下游地区Ⅳ和Ⅱ菌为优势小种，华南稻区Ⅴ型菌为优势小种，本研究在结合以往研究基础上选用Xa21和Xa7 2个抗性基因[24]。结果显示Xa7和Xa21均有各自的致病小种，在水稻抗性基因轮换使用及聚合育种等方面有重要意义，同时也表明本研究的2个抗性基因的选择是科学合理的。

3.2　改良组合的应用评价

分子标记辅助选择改良过程中，常用的是对目标基因进行前景选择和目标单株背景选择相结合。本研究没有进行特定背景选择，目的是在进行选择与轮回亲本性状一致的基础上，也希望能选择一些新类型材料。但在每个世代回交、自交过程中选择阳性单株，均选择与轮回亲本性状一致的单株回交、自交，且在每一世代都采用人工接种与基因型相结合的选择方式，以提高选择准备率。本研究目的是在保持丰香恢1号优良性状不变的基础上提高其对白叶枯病的抗性。研究过程中，得到含有不同抗性基因的改良株系20个，最终选择出3个改良株系进行分析。从研究结果可以看出，这3个改良株系及其所配杂交组合的抗性明显提高，产量及品质方面与对照基本一致或优于对照，特别是组合广占63-4S/X03(Xa7+Xa21)可以作为丰两优香1号的替换组合用于水稻生产。

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