2种提取野生蕈菌DNA方法的比较及其应用

何山文 雷琼 马立安

( 长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)( 湖北省荆州市文物保护中心，湖北 荆州 434020)( 长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

传统的真菌鉴定多以形态学为依据，存在不确定性，对于少见真菌诊断困难。随着分子生物学技术的发展，真菌可鉴定至种的水平。目前实验室对于难鉴定的真菌多采用PCR扩增结合测序分析的方法[1]，该法具有准确、简单、快速、实用性强的特点，而进行PCR扩增首先需要提取真菌基因组DNA，因此探索出快速、高效、安全的真菌基因组DNA抽提法显得尤为重要。

目前提取真菌DNA的方法较多，包括十六烷基三甲基溴化铵( CTAB)法[2]、十二烷基磺酸钠( SDS)法[3]、氯化苄法[4]等，但不同真菌类群适用的方法可能存在一定差异[5]。本研究通过改良的CTAB法和SDS-CTAB法提取真菌子实体DNA并进行比较，以期获得一种高效、高质地提取真菌子实体DNA的方法，应用于野生蕈菌的分类鉴定。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品

供试野生蕈菌4#、6#、8#、16#、18#、19红、22#、26#、30B#、34#、36#、37#、48#、51#、60#、61#等样品在2012年8月采集于英国诺里奇东英吉利亚大学校区附近，样品子实体在恒温鼓风干燥箱50℃烘干，粉碎保存于长江大学生命科学学院实验室。其中DNA提取方法的比较试验所用样品为4#样品。

1.1.2主要试剂

Taq酶、Goldview核酸染料、PCR相关试剂和DL2000 DNA Marker等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；上游引物ITS5和下游引物ITS4，由生工生物工程( 上海)股份有限公司合成。

2% CTAB提取液：20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA( pH 8.0)，100mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

1% CTAB沉淀液：10g/L CTAB，10mmol/L EDTA( pH 8.0)，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

2% SDS提取液：20g/L SDS，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，1.4mol/L NaCl ，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

5% CTAB沉淀液：50g/L CTAB，1.0mol/L NaCl，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，250mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA( pH 8.0)。

1.2　方法

1.2.1DNA提取方法

1)CTAB法参照文献[5]的方法略加改动。具体步骤为：①称取4#样品干燥粉末0.15g于预冷的研钵( 研钵于-80℃冰箱过夜放置)中，加入于65℃预热的2% CTAB提取液快速碾磨成粘稠糊状，然后将碾磨好的液体转入50mL圆底离心管，提取液总共用3mL。②将装有样品的离心管放入65℃恒温摇床振荡1h，以使其充分裂解。③加入等体积3mL氯仿/异戊醇( 24∶1)，振荡混合均匀，4℃12000r/min离心10min，取上清，转移到干净50mL圆底离心管中，记下转移上清体积。④加入1.4倍于上清体积的1% CTAB沉淀液，混合均匀，室温沉淀30min。12000r/min离心10min，( 可看到微量沉淀)吸走部分上清，将剩下的( 约2mL)转移到2个1.5mL EP管中，12000r/min离心10min，弃上清。⑤加450μL无菌水，溶解混匀，再加900μL冷无水乙醇置4℃沉淀30min，12000r/min离心10min，弃上清。⑥洗涤DNA：用300μL 75%乙醇涡旋洗涤，12000r/min离心15min，弃上清，再加入无水乙醇洗涤，弃上清，干燥30min。⑦每管加入30μL TE缓冲液充分溶解DNA后在-20℃下保存备用。

2)SDS-CTAB法参照文献[6]的方法略加改动。具体步骤为：①称取4#样品粉末0.15g于预冷的研钵( 研钵于-80℃冰箱过夜放置)中，加入于65℃预热的2% SDS提取液快速碾磨成粘稠糊状，将碾磨好的液体转入50mL圆底离心管，提取液总共用3.5mL。②将装有样品的离心管放入65℃恒温摇床振荡1h。③12000r/min离心10min，取上清，转移到干净50mL圆底离心管中，记下转移上清体积。④加入等体积的5% CTAB沉淀液，混合均匀，放入65℃恒温摇床振荡10min。加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇( 25∶24∶1)，混匀，12000r/min离心10min，取上清，转移到干净50mL圆底离心管中，记下转移上清体积。⑤加入等体积的氯仿/异戊醇( 24∶1)，混匀，12000r/min离心10min，可看到清晰界面，取上清，转移到干净50mL圆底离心管中，记下转移上清体积。⑥加入等体积异丙醇，混匀，置-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min，去掉部分上清，将剩下的( 约2mL)转移到2个1.5mL离心管中，12000r/min离心10min，弃上清。⑦洗涤DNA：加入300μL 75%乙醇至离心管中，用手指轻弹离心管壁，颠倒混匀，温和洗涤，12000r/min离心15min，弃上清，再加入无水乙醇洗涤，弃上清，在通风干净的地方干燥30min。⑧每管加入30μL TE缓冲液，涡旋溶解。

1.2.2DNA样品的检测

0.8%琼脂糖凝胶电泳。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液，吸取10μL TE溶解的DNA与适量的6×loading buffer上样缓冲液吹吸混匀，电压80V，30min至DNA跑到胶体2/3时，将胶体拿出放到凝胶成像室成像，并保存电泳图片。

1.2.3PCR扩增

PCR引物为通用引物：上游引物ITS5( 5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’)和下游引物ITS4( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

PCR反应体积为25μL，其体系为2.5μL 10×Taq Buffer，2.5μL dNTPs( 2mmol/L)，0.5μL Taq( 2U/μL)，0.5μL上游引物( 10μmol/L)，0.5μL下游引物( 10μmol/L)，16.5μL ddH2O，2μL DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min。

扩增产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳，产物和Mark上样量均为5μL，电泳结果于Bio-Rad凝胶成像系统成像。

1.2.4野生蕈菌的分子系统学鉴定

采用比较分析得到的优势DNA提取方法，提取16种供试野生蕈菌DNA，进行PCR扩增、测序和BLAST比对，列邻接法构建系统发育树进行分子系统鉴定[7]。并采用MEGA 7.0软件进行聚类分析。

2　结果与分析

1～2:CTAB法； 3～4:SDS-CTAB法图1　2种方法提取的DNA电泳图

1～2:CTAB法提取DNA不稀释扩增产物；M:Marker 3:SDS-CTAB法提取DNA稀释10倍扩增产物4:SDS-CTAB法提取DNA稀释100倍扩增产物图2　2种方法提取DNA的PCR扩增产物电泳图

2.1　2种方法提取的DNA电泳结果比较

2种方法提取的DNA电泳图如图1所示。由图1可知，用CTAB法提取的DNA电泳条带( 1～2泳道)亮度低，显示DNA量较少，SDS-CTAB法得到的电泳条带( 3～4泳道)亮度高且完整，显示DNA产量较高且质量好，但有大量的RNA。这表明，2种方法比较，SDS-CTAB方法提取的DNA产量高、质量好。

2.2　2种方法提取DNA的PCR扩增产物比较

选择ITS5/ITS4为引物，以CTAB法提取的DNA

作模板进行PCR扩增，SDS-CTAB法提取的DNA分别稀释10倍和100倍后进行PCR扩增，样品扩增产物电泳图如图2所示。2种方法提取的DNA都能扩增出清晰可辨的条带而且没有杂带，说明2种方法提取的DNA都适合用于PCR分析研究。但图2结果显示，SDS-CTAB法提取的DNA用于PCR扩增需要模板用量少( 1%，稀释100倍)，可应用于后续蕈菌子实体DNA鉴定。

2.3　SDS-CTAB提取DNA方法的应用

对采集到的16个野生蕈菌样品采用SDS-CTAB法提取DNA并进行测序，经BLAST比对，鉴定为13个种，其中有4个样品为同一种菌( 硫磺菌)。13个样品序列提交到NCBI，获得登录号，具体结果如表1所示，其类群结构如图3所示。结果表明，采用SDS-CTAB法所提取的DNA可以作为模板用于PCR扩增、测序和分类鉴定等后续研究。

表1　野生蕈菌分子鉴定结果汇总

图3　13种野生蕈菌类群结构

3　讨论与结论

3.1　讨论

基因组的产率和纯度对后续实验如酶切、PCR、杂交等有重要影响。因此，DNA的提取是至关重要的一步。CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，去除菌体细胞壁中的多糖、酚复合物，与核酸结合形成复合物，其溶解度随盐溶液的浓度变化，可作为真菌DNA提取的优良溶剂[8]，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖和酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来[9]。SDS在高温( 55～65℃)条件下能裂解细胞，使染色体离析和蛋白变性，与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸[10]。

同一样品采用不同方法或不同样品采用相同方法提取DNA的纯度和提取率有很大差异[11]。本研究采用CTAB和SDS-CTAB提取食用菌DNA得到的质量相近，称取同样重量的样品，SDS-CTAB提取到的DNA浓度比CTAB方法提取的要高。2种方法首先都是用预热的裂解液对样品进行碾磨，裂解之后CTAB方法用氯仿/异戊醇( 24∶1)处理离心，预先去除了部分蛋白质，这一步操作的不同导致2种方法结果的优劣差异，因为在去除杂质的同时会带走一部分DNA，造成损失。使得CTAB方法提取的DNA量偏少，而SDS-CTAB方法提取的DNA量多。

真菌多样性丰富，基于某一种真菌提取DNA得到的结论并不一定适用于其他真菌[4]。SDS-CTAB法提取的DNA成功用于13种野生蕈菌的鉴定，表明SDS-CTAB法提取的DNA能够满足许多野生蕈菌进行分子鉴定提取基因组DNA的需要。

3.2　结论

1)CTAB法和SDS-CTAB法都可提取真菌子实体DNA，并可直接用于PCR扩增分析。

2)SDS-CTAB法提取DNA产量高质量好，操作也简便，推荐应用于蕈菌DNA分子生物学中研究。

3)SDS-CTAB法可成功用于13种蕈菌的分子鉴定，并建立类群结构图。

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