氟康唑清除hk-2细胞霉菌污染的研究

王议鹤 王勤章 吴 双 褚 浩 钱 成 徐 浩 钱 彪

（石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆石河子 832000）

细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染[1]。细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。本研究针对hk-2细胞培养中发现霉菌污染时，对比不同浓度氟康唑处理污染的效果及细胞状态，结果如下。

1 资料与方法

1.1 细胞污染情况

在近期用细胞时，出现了细胞污染现象。倒置显微镜高倍镜可观察到培养液中有黑色丝团状物夹杂在细胞中生长，有的看似有根，其上部的黑色丝团状物可随培养液的晃动而晃动。但培养液澄清，未发生浑浊，细胞生长缓慢[2，3]。

1.2 方法

（1）培养方法

在无菌条件下将受污染的细胞培养液100 p。涂布于PDA平板，300 C倒置培养72 h，观察其菌落形态。

（2）污染的去除

吸弃受污染的旧培养液，用PBS冲洗培养瓶两遍，用10%及20%浓度氟康唑进行清除，1次/d，持续10 d，同时每天镜下仔细观察细胞生长情况。

2 结果

2.1 污染类型的初步鉴别结果

72 h后，平板上生长出直径约2～3 mm表面湿润、粘稠且隆起的圆形乳白色菌落，怀疑为酵母菌。用接种环取少量疑似为酵母菌的菌体，置于载玻片中英的无菌生理盐水中，加盖玻片。在高倍镜下观察，多数为5～10 pm的卵圆形单细胞，部分有出芽现象。

2.2 药物处理结果细胞

经1次/d的冲洗、换液、不同浓度氟康唑处理后，污染得到明显的控制，镜下观察黑色丝团状物逐日减少，细胞生长趋势尚可，未发现有异常现象。加药过程中可正常传代，持续10 d后，镜下已无真菌生长，细胞生长良好，可用于试验，与正常未受污染的细胞无明显差异。

3 讨论与结论

3.1 污染类型

细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染[4]。其中，细菌方面，细菌污染常见的有大肠杆菌，葡萄球菌等。细菌污染较易发现，在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，培养液一般会在短时间内变黄，有时静置的培养液不混，稍加震荡会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。在培养液中加入相应的抗生素，能够预防绝大多数的细菌污染。真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其临近梅雨季节，细胞培养时更易污染。污染细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠[5]；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。真菌生长的比较慢，不容易被发现，但是一旦发现就表明细胞被污染了，也很难救活。支原体的大小介于细菌和病毒之间，是一种独立生活的微生物。对热敏感，对一般抗生素不敏感。支原体的形态多变，多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察，中心有高密度的密集颗粒，横断面与细胞微绒毛相似。因国内的血清大多数都没有做支原体阴性检测，而支原体又是牛血清中最常见的微生物之一。支原体污染细胞后，培养液轻微发生混浊，但细胞变化不显著，随着细胞的培养会慢慢死亡。DNA和与DNA特异性结合的荧光染料结合，使得支原体的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

3.2 污染处理

污染是细胞培养的大敌，预防和避免污染是成功培养细胞的关键之一。危机意识要贯彻实验的始终，否则不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。本次研究中，经1次/d的冲洗、换液、不同浓度氟康唑处理后，污染得到明显的控制，镜下观察黑色丝团状物逐日减少，细胞生长趋势尚可，未发现有异常现象。加药过程中可正常传代，持续10 d后，镜下已无真菌生长，细胞生长良好，可用于试验，与正常未受污染的细胞无明显差异。氟康唑又名大扶康，是一种新型三唑类抗真菌药物，有广谱抗真菌作用，对真菌细胞色素P-450依赖酶的抑制作用具有高度选择性，能选择性地抑制真菌的甾醇合成。一旦发生真菌污染且污染细胞的价值较大，可选用10%的氟康唑氯化钠注射液加以去除，污染得到控制后还应在不加药物的培养基中培养4～6代，确定污染是否已被消除[5]。实验表明，氟康唑能有效的抑制细胞培养基中真菌的生长和繁殖，而且在有效抑菌浓度范围内氟康唑对细胞无明显毒性，可应用于细胞培养，去除细胞培养过程中真菌污染。

污染重在预防，预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法，能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：（1）从操作者做起操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5 min，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。（2）从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。（3）防止细胞交叉污染。在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。

综上所述，采用10%及20%浓度氟康唑进行清除，细胞生长良好，可用于试验，与正常未受污染的细胞无明显差异，10%浓度氟康唑既能灭菌又不对细胞造成影响。

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