SPR在野菊花黄酮与淀粉相互作用的应用研究

佘银，李跑，高婉茹，黄昭，刘霞

（湖南农业大学食品科学技术学院食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410000）

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢综合征，它与多种器官损伤和功能障碍有关，并已成为全球慢性非传染性疾病中最普遍的一种疾病[1-3]。至2040年，糖尿病患者人数将达到6.42亿人[4]。其中，2型糖尿病（diabetes mellitus，type 2，T2D）占全球糖尿病病例总数的90%以上。目前，控制餐后高血糖是治疗T2D的一个主要方式[5-6]。而食物中碳水化合物的消化是餐后血糖升高最主要的原因。由于日常生活中人们摄食的主要碳水化合物为淀粉，而淀粉的“质”和“量”直接影响着血糖的调节。因此，可以通过增强淀粉的抗性，降低和延缓淀粉的消化来控制人体餐后血糖的升高。

黄酮类化合物广泛存在于水果、蔬菜、茶叶和药用植物中，是一类具有多种生物活性的物质，如抗氧化、防癌、抗癌、抗炎等活性[7-8]。研究表明，黄酮类化合物可在口腔和胃肠道中抑制淀粉酶的催化活性，阻碍食品和消化过程中碳水化合物的水解，从而有效地降低餐后血糖水平，达到预防和辅助治疗糖尿病的效果[9]。野菊花作为一种传统的中药，已经被使用了好几个世纪[10]。野菊花中含有大量黄酮类化合物，主要包括蒙花苷、刺槐素和木犀草素[11]（图1）。

图1　蒙花苷、刺槐素和木犀草素的化学结构Fig.1　Chemical structures of buddleoside，acacetin，luteolin

在野生菊花的质量控制方面，也是以这3种化合物的含量为标准[11]。目前，对野菊花的研究和利用主要为消除风和热，去除肝脏热毒[12]，很少有关于野菊花黄酮降血糖作用的研究，野菊花黄酮和淀粉相互作用的研究就更少。研究野菊花黄酮和淀粉的相互作用，一方面有助于了解淀粉理化性质以及野菊花黄酮调节餐后血糖水平的途径与能力。另一方面，也为野菊花在食品工业和保健食品工业中的应用提供了有益的参考。表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）是评价分子间相互作用的最有力技术之一，本研究利用SPR传感器研究了3种野菊花黄酮与淀粉的实时动力学分析，分别获得了3种黄酮与淀粉相互作用的结合常数Ka、解离常数Kd和平衡解离常数KD。在此基础上，研究了3种野菊花黄酮对淀粉消化的影响。并且探讨了淀粉对野菊花黄酮抗氧化活性的影响。通过对上述3方面的研究，探究这3种野菊花黄酮与淀粉作用的构效关系。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

蒙花苷（纯度：99.37%）、刺槐素（纯度：99.8%）和木犀草素（纯度：98.92）：中国检定研究院；枯草杆菌α-淀粉酶、可溶性淀粉和阿卡波糖：长沙隆和化玻实验用品有限公司；巯基丙酸（3-Mercaptopropionic，MPA）、N-羟基丁二酰亚胺 （n-hydroxysuccinimide，NHS）、碳二亚胺（1-ethyl-3-（3-dimethylami-nopropy1）carbodiimide，EDC）：美国 Sigma-Aldrich 公司；常用试剂：国药集团化学试剂北京有限公司。

1.2　仪器与设备

分析天平（AUY220）：日本岛津；pH计（Testo205）：德国仪器国际贸易上海有限公司；超声波清洗器（KQ-100）：昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅（DK-S28）：上海精宏实验设备有限公司；全波长酶标仪（Multisk Go1510）：芬兰；表面等离子体共振仪（BISPR-2000）：美国 Biosensing Instrument。

1.3　方法

1.3.1　MPA在传感器芯片表面的自组装

依据文献介绍的步骤[13]，取出全新金片，无水乙醇浸泡5 min后，用超纯水清洗数次，氮气吹干，将其安装在SPR传感器棱镜上，随后安装好流通池，通入（10 mmol/L、pH6）磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline，PBS）作为载液，试验过程中流速为10 μL/min。待基线平稳后，利用氨基偶联的方法，通入100 μL、10 mmol/L MPA溶液，使MPA在传感器表面进行自组装，形成自组装的单分子膜（MPA一端的巯基连在金片上，另一端的羧基露在外侧）。然后通入100 μL、0.4 mol/L/0.1mol/L EDC/NHS混合溶液，活化MPA中的游离的羧基。

1.3.2　淀粉在传感器芯片表面固定的最佳浓度

称取3.4mg淀粉，加入1 mL煮沸的超纯水，使其完全溶解。用PBS稀释成系列浓度（10、20、40、80、160、240、300、400、500μmol/L）。调节SPR流速为10μL/min，将淀粉溶液（低溶度→高浓度）依次通入已活化的传感器芯片上，记录SPR响应信号。绘制不同浓度淀粉溶液与SPR响应信号之间的工作曲线，找到淀粉的最佳固定浓度。每个浓度淀粉溶液进行3次平行试验，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3　3种黄酮与淀粉相互作用的SPR分析

在传感器芯片表面固定最佳浓度的淀粉溶液之后，向流通池通入系列梯度浓度的黄酮溶液（100、200、400、800 μmol/L），进行 SPR 检测，反应时间约为 600 s。每次反应完成后用2 mmol/L NaOH进行再生，进行下一浓度试验，每个浓度平行3次。绘制黄酮与淀粉相互作用的实时动力曲线图，获得SPR响应信号。并且通过SPR自带软件（version 2.2.0）对动力学曲线进行拟合，得到3种黄酮与淀粉相互作用的动力学常数。

1.3.4　野菊花黄酮对淀粉消化的影响

参考文献[14]，本试验分对照组和抑制剂组。对照组的具体操作如下：取2 mL、0.1 mol/L淀粉悬浮液，加入 0.05 mL、300 μmol/L 酶溶液，37 ℃下消化 5 min后，马上加入0.5 mL、0.01 mol/L碘应用液终止反应，摇匀后560 nm处测其吸光度。抑制剂组：取2 mL、0.1 mol/L淀粉悬浮液，分别加入0.5 mL不同浓度（10、50、100 μmol/L）的蒙花苷、刺槐素和木犀草素，祸旋震荡混匀5 min，后续过程与对照组一致。具体剂量添加如表1所示。

表1　淀粉消化反应体系Table 1　Starch digestive system

野菊花黄酮对淀粉消化的抑制率计算公式为：

式中：A0原始淀粉消化能力，A0=A2-A1；A0′加抑制剂（黄酮）后淀粉消化能力，A0′=A4-A3。

1.3.5　淀粉对野菊花黄酮清除DPPH自由基的影响

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl，DPPH），是一种极其稳定的氮中心自由基，在无水乙醇中呈紫色，最大吸收峰在517 nm处，吸光度与浓度呈线性关系，向其中加入自由基清除剂时，可以结合或代替DPPH自由基，使自由基数量减少[15]。本研究分别取1 mL不同浓度的野菊花黄酮（终浓度：2.5 μmol/L～125 μmol/L）溶液，加或不加 0.2 mL、300 μmol/L 淀粉，5 min 后，加入 1 mL、2 mmol/L DPPH溶液，混匀后，加入适量无水乙醇，使反应的总体积为5 mL，在室温下避光放置20 min，在517 nm处测定吸光度。根据得到样品对DPPH自由基的清除率[13]。

DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

式中：Ai为黄酮样液（有无淀粉）与DPPH反应液的吸光度值；Aj为黄酮样液与无水乙醇反应液的吸光度值；Ac为无水乙醇与DPPH反应液的吸光度值。

2　结果与分析

2.1　淀粉在传感芯片表面固定的最佳浓度

淀粉固定的浓度对于后续试验顺利进行是至关重要的。固定浓度太低，传感器芯片表面没有被淀粉充分覆盖，裸露的结合位点较多，一方面可能会发生非特异性吸附，另一方面会导致淀粉与野菊花黄酮相互作用不够完全；若固定浓度太高，样品会在传感器芯片表面出现堆积现象，结合不牢固，同时造成不必要的试剂损失[16-17]。不同浓度淀粉的SPR响应信号曲线见图2。

图2　不同浓度淀粉的SPR响应值曲线Fig.2　SPR signal graph of series concentration of starch

如图2所示，随着淀粉浓度的增大，SPR响应值也随之增大，当淀粉浓度为300 μmol/L时，SPR响应值达到249.33 mDeg。浓度超过300 μmol/L，SPR响应值无明显增长。故本试验选取300 μmol/L为淀粉在传感器芯片表面固定的最佳浓度。

2.2　野菊花黄酮与淀粉相互作用的实时动力学分析

在传感器芯片表面固定好淀粉之后，向流通池通入不同浓度的不同黄酮溶液，进行SPR相互作用检测。图3～图5分别为不同浓度蒙花苷、刺槐素、木犀草素与300μmol/L淀粉相互作用的SPR实时动力学曲线图。

图3　淀粉与蒙花苷相互作用的动力学曲线图Fig.3　SPR kinetic curves of immobilized starch binding buddleoside

图4　淀粉与刺槐素相互作用的动力学曲线图Fig.4　SPR kinetic curves of immobilized starch binding acacein

图5　淀粉与木犀草素相互作用的动力学曲线图Fig.5　SPR kinetic curves of immobilized starch binding luteolin

可以看出，随着黄酮浓度的增大，SPR动力学曲线也有明显的变化。根据理论1∶1模型可得到蒙花苷、刺槐素和木犀草素与淀粉相互作用的结合速率（Ka）、解离速率（Kd）和平衡解离常数（KD）。这些动力学常数在表2中有详细给出。图6为不同浓度情况下，3种黄酮与淀粉相互作用的SPR响应值比较图，随着黄酮浓度的增大，它们与淀粉相互作用的SPR响应值也随之增强，木犀草素与淀粉相互作用能力最强，刺槐素次之，蒙花苷最弱。

表2为通过SPR自带软件（version 2.2.0）对动力学曲线进行拟合得到的动力学常数。

图6　不同浓度下3种黄酮与淀粉相互作用的SPR响应值比较图Fig.6　The SPR response of the different concentration of three flavonoids with starch

表2　蒙花苷、刺槐素和木犀草素与淀粉相互作用的动力学参数Table 2　Kinetic parameters for buddleoside，acacetin and luteolin binding to immobolized starch

由表2可知，蒙花苷、刺槐素和木犀草素与淀粉作用的 KD值分别为 （4.822 4±0.06）、（3.441 3±0.06）、（2.367 6±0.25）mmol/L。如图1所示，对比木犀草素，发现蒙花苷和刺槐素B环的C-5’位缺少一个羟基，并且在C-4’羟基甲氧基化。而蒙花苷结构与刺槐素结构相似，但是在A环C-7位羟基被糖苷取代后，分子大小和极性都增加，结构转移到非平面上，位阻的增大削弱了蒙花苷与淀粉之间的结合[18-20]。所以，3种黄酮与淀粉作用的亲和力大小为：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。结果表明，羟基基团的数目和位置对于黄酮与淀粉的结合至关重要。

2.3　野菊花黄酮对淀粉消化的影响

阿卡波糖是一种用于治疗糖尿病的新型口服降糖剂，它能减少多糖和蔗糖在肠道内分解为葡萄糖，从而减少糖的吸收，达到降低人体餐后血糖水平的效果。图7为不同浓度下，3种野菊花黄酮以及阿卡波糖对淀粉消化的抑制效果图。

如图7所示，阿卡波糖对淀粉消化的抑制能力最强。但是，阿卡波糖使糖类在小肠内的分解和吸收受到障碍而停留时间过长，肠道细菌的发酵会产生更多的气体，会导致机体产生腹胀、腹痛和腹泻等不适症状[21-23]。因此，被证实相对安全的黄酮类化合物可能是另一种选择。3种野菊花黄酮对淀粉消化的抑制能力相差不大，随着黄酮浓度的增大，它们对淀粉消化能力的抑制能力也逐渐增强，并且，抑制能力：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。当木犀草素的浓度为100 μmol/L时，其对淀粉消化的抑制率为26.7%。

图7　蒙花苷、刺槐素、木犀草素和阿卡波糖对淀粉消化的抑制效果Fig.7　The inhibition effect of buddleoside，acacetin，luteolin and acarbose on starch digestion

2.4　淀粉对野菊花黄酮清除DPPH自由基的影响

黄酮类化合物大多具有较高的抗氧化活性[24]。本试验采用DPPH自由基清除法评价了3种野菊花黄酮与淀粉相互作用后，黄酮抗氧化能力的变化情况。表3为淀粉对3种黄酮清除DPPH自由基的抑制作用。

表3　淀粉对3种黄酮清除DPPH自由基的抑制作用Table 3　Inhibition of starch on scavenging DPPH·capacity of three flavonoids

由表3所示，比较3种野菊花黄酮清除DPPH自由基的半抑制率浓度IC50，它们对DPPH自由基有不同程度的清除作用，且木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。在加入一定浓度淀粉溶液之后，发现3种黄酮清除DPPH自由基的能力下降。并且，淀粉对它们清除DPPH自由基的抑制作用为：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。这个结果与2.2、2.3结果一致，进一步证实了这3种黄酮抗氧化能力与其本身的羟基数目和位置有关，B环是黄酮类化合物抗氧化能力的重要活性部位[25]。

3　结论

利用SPR技术，建立了一种快速、高灵敏的分析方法以实时监测3种野菊花黄酮与淀粉的相互作用，获得了它们相互作用的动力学参数，木犀草素与淀粉相互作用能力最强，刺槐素次之，蒙花苷最弱，并且初步探讨了它们相互作用的构效关系；研究了3种野菊花黄酮对淀粉消化的影响，为野菊花黄酮在富含淀粉类食品中的应用提供了理论依据；评价了3种野菊花黄酮与淀粉作用后，其抗氧化活性的变化情况。野菊花黄酮与淀粉发生相互作用后，不仅影响淀粉的消化，同时自身的生物活性也会受到影响。

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