长江水系细鳞斜颌鲴形态特征及生化遗传特性分析

张林, 周剑光, 张涛, 何力

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心，武汉 430072)

细鳞斜颌鲴 (Xenocyprismicrolepis)，俗称沙姑子、黄尾刁、板黄鱼、黄条、黄片等，隶属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲴亚科(Xenocyprininae)、斜颌鲴属(Plagiognathops)[1]。主要摄食腐殖质、有机碎屑、蓝藻、绿藻、硅藻等，享有“环保鱼”的美誉[2]，饲养简便。在不增加饲料的情况下，能提高单位面积产量，且不与鲢、鳙等争食，可以与其混养。由于其具有肉味鲜美、体型中等、生长速度快、养殖病害少，可改善水质等特点，近年来，许多地区开展了细鳞斜颌鲴的苗种繁育、人工养殖及增殖放流等工作[3-6]。目前有关细鳞斜颌鲴的报道主要集中在养殖技术与模式[3,7]、乳酸脱氢酶[8-9]、线粒体DNA基因[10-11]的研究。对其种质资源研究报道不多见，对长江水系细鳞斜颌鲴群体生物学性状及生化遗传特性分析的研究未见报道。因此，本研究采用传统的可数性状和可量性状遗传学方法，描述其生物学性状，研究其细胞遗传特性及生化遗传特性，旨在为其种群鉴定、种质标准制定、种质资源保护及利用提供基础资料。

1　材料与方法

1.1　实验材料

细鳞斜颌鲴(Xenocyprismicrlepis)取自湖北省丹江水库，样本数量为30尾，体长为23.7～29.6 cm，体重为228.84～457.94 g。

1.2　形态学数据测量

采用量鱼板、游标卡尺、直尺、三角板等测量工具，精确到0.01 cm。传统形态学数据的获得，参照殷名称方法[12]，包括可数性状和可量性状两类。可数性状分别为侧线鳞数、侧线上鳞数、侧线下鳞数、左侧第一鳃弓外侧鳃耙数、背鳍不分支鳍条数、背鳍分支鳍条数、臀鳍不分支鳍条数和臀鳍分支鳍条数，共计8项指标。可量性状包括全长、体长、体高、头长、吻长、眼径、眼间距、尾柄长和尾柄高，共计9项指标。

1.3　染色体的制备

取雌雄鱼各3尾，经腹腔注射5 μg/g植物血球凝集素(PHA)，继续饲养24 h后，腹腔注射2 μg/g秋水仙素，2.5 h后剪鳃放血，取出头肾。在生理盐水中将头肾剪成1 mm3，静置10 min，取上层细胞悬液1 000 g离心6 min，沉淀加入0.037 5 mol/L的KC1 5 mL，室温低渗45 min。加少许卡诺氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1,V∶V)预固定2～3 min 后1 000 g离心6 min，沉淀加入预冷的卡诺氏固定液，吹打均匀后室温下静置30 min使其固定，然后置于离心机中以1 000 g离心6 min，离心后倒去上清液。如此重复3次后，空气干燥法制作涂片，15%Giemsa染色。

1.4　染色体检查与形态测量

中期分裂相用16倍目镜和100倍油镜在显微镜(Olympus CX41，日本)下观察拍摄，选择拍摄了100张清晰的染色体中期分裂相，进行染色体个数统计，确定染色体众数。染色体大小形态用Photoshop Software 7.0测量(精度0.01 μm)。挑选具有代表性的5张有丝分裂中期相，给染色体按照着丝点分割点位置进行排号(1～48)，测量每条染色体的长臂长、短臂长和总长，计算相对长度、着丝粒指数和臂比等。每对同源染色体取短臂与长臂均值。所有的测量数据用Excel进行统计分析，而后按照组型归类。

1.5　染色体配对

着丝粒指数(CI)指每对染色体短臂均值长与此对染色体总长之比。相对长度指每对染色体总长和所有染色体总长之比。根据同源染色体总长及着丝粒位置的最大相似性进行配对。臂比指长臂长与短臂长之比。按臂比及着丝粒指数将染色体分为4组：中部着丝粒染色体M组，臂比为1.00～1.70，着丝粒指数(CI)为0.375～0.500；亚中部着丝粒染色体SM组，臂比为1.71～3.00，着丝粒指数(CI)为0.250～0.375；亚端部着丝粒染色体ST组，臂比为3.01～7.00，着丝粒指数(CI)为0.125～0.250；端部着丝粒染色体T组，臂比为7.01～∞，着丝粒指数(CI)为0.000～0.125[13]。在每组内根据同源染色体长度逐渐下降的顺序排列。

1.6　同工酶电泳分析

选取20尾健康鱼，首先剪断鳃丝放血，在低温条件下迅速解剖，取出脑、心、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉和眼睛7种组织，并在玻璃匀浆器中匀浆(冰上操作)，组织和提取缓冲液质量体积比为1∶3，提取液为0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.1)，4 ℃下8 000 g离心20 min后取上清液，离心2次，置于-20 ℃下保存备用。

采用7%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，以溴酚蓝作指示剂，4 ℃条件下，当溴酚蓝指示剂至凝胶底部时停止电泳。电泳结束后将凝胶板取下，在乳酸脱氢酶染色液中避光染色至带出现，显色至出现清晰条带后固定[14]。

1.7　数据分析

每个可数性状用SPSS 11.0单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后采用Duncan法作群体间差异显著性分析,P<0.05为差异性显著。

2　结果分析

2.1　主要生物学特征

鲴体侧扁，背鳍起点处较高，体稍厚，腹部稍圆。鳃盖后边缘有明显的橘黄色斑块。腹部从腹鳍基至肛门间有明显腹棱。头小，吻钝，口下位，横裂，略呈弧形。下颌的角质边缘比较发达。背鳍有光滑硬刺，硬刺长度较头长大。背部灰褐色，腹部银白色，臀鳍浅黄色，尾鳍桔黄色，后缘黑灰色。鳞片细小，排列紧密(图1)。有鳔管，2室。咽喉齿3行，齿式为2·4·6/6·4·2。

图1　细鳞斜颌鲴外形图Fig.1 The outside view of Xenocypris microlepis

侧线鳞数为70～78，侧线上鳞数为13～14，侧线下鳞数为7～8，左侧第一鳃弓外侧鳃耙数为33～41，背鳍不分支鳍条数为3，背鳍分支鳍条数为7，臀鳍不分支鳍条数为3，臀鳍分支鳍条数为11～12。细鳞斜颌鲴背鳍鳍式：D.ⅲ-7；臀鳍鳍式：A.ⅲ-11～12。细鳞斜颌鲴可数性状及可量性状比值见表1。

2.2　细胞遗传学性状

在拍摄的100张染色体照片中，有90张为有丝分裂中期相属于二倍体，染色体个数范围为42～52，众数为48的有72张(图2)，占有丝分裂中期相的80%；其余10张为减数分裂期(细胞处于浓缩期)，染色体个数在23～24，而染色体个数为24的有7张(占减数分裂相的70%)；由此推断长江水系细鳞斜颌鲴属于二倍体，染色体个数为48, 减数分裂期时属于单倍体；此外，未发现与性别有关的异形染色体。

挑选众数为48的5张具有代表性的有丝分裂相，测量时取其平均值，总长度范围为50.30～90.15 μm。有10对中部着丝粒染色体，其长臂长、短臂长和总长度范围分别为33.05～43.4、26.45～36.65和60.80～80.05 μm；相对长度、着丝粒指数、臂比范围分别为3.74%～4.92%、0.413～0.466和1.145～1.420。有12对亚中部着丝粒染色体，其长臂长、短臂长和总长度范围分别为34.50～64.20、15.65～28.4和50.30～90.15 μm；相对长度、着丝粒指数和臂比范围分别为3.09%～5.54%、0.288～0.357和1.803～2.474。有2对亚端部着丝粒染色体，其长臂长、短臂长和总长度范围分别为12.05～15.70μm、40.9～54.45和52.95～70.15 μm；相对长度、着丝粒指数和臂比范围分别为3.26%～4.31%、0.224～0.228和3.394～3.468(表2)，但本观察中未见端部着丝粒染色体。

表1　30尾细鳞斜颌鲴可量性状比值及可数性状Tab.1　Comparatives of measurable characters and countablecharacters of 30 Xenocypris microlepis　n=30

表2　细鳞斜颌鲴染色体有丝分裂中期相核型分析相关参数Tab.2　Numeral characteristics of the karyotype of Xenocypris microlepis showing the mean values of measurements from mitotic metaphases

注：M表示中部着丝点染色体，SM表示亚中部着丝点染色体，ST表示亚端部着丝点染色体。

每组中的同源染色体按总长逐渐减小的顺序排列，细鳞斜颌鲴染色体中期分裂相及核型图(图2、图3)，核型公式为2N=20M+24SM+4ST，臂数NF=92。

图2　细鳞斜颌鲴肾脏细胞染色体中期分裂相Fig.2 The kidney mitotic metaphase of Xenocypris microlepis (2N=48,Bar=5μm)

图3　细鳞斜颌鲴肾脏细胞染色体核型图Fig.3 Karyotype of Xenocypris microlepis(2N=48,Bar=5μm)

2.3　生化遗传学性状

为制定细鳞斜颌鲴种质遗传鉴定行业标准，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，随机选取分析了20尾健康细鳞斜颌鲴心、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、脑和眼睛7种组织中乳酸脱氢酶(LDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和山梨醇脱氢酶(SDH) 6种常见的同工酶的表达模式，并对各同工酶的酶谱进行了分析。发现肾脏和肌肉中的乳酸脱氢酶(LDH)为均为单态，观察到5个基因座，显示5条清晰的同工酶谱带。可作为细鳞斜颌鲴区别其他鱼类特有的生化遗传学特性，其他不同组织同工酶可供细鳞斜颌鲴群体遗传结构分析，将不再此文中赘述。

2种组织乳酸脱氢酶酶型相似，活性均较强，且均为单态。由Ldh-A、Ldh-B两个基因编码的四聚体酶，分别为A4、A3B、A2B2、AB3和B4。选择有代表性的5尾鱼肌肉与肾脏组织中LDH做电泳。由图4和图5可见，在迁移率和某些酶带的着色浓度上存在细微差别，显示同种酶在同种鱼类上的组织特异性。肾脏LDH1～LDH2表达丰度略高于肌肉组织。两种组织中均是LDH3(A2B2)、LDH4(A3B)和LDH5(A4)占明显优势。

图4　细鳞斜颌鲴肌肉组织乳酸脱氢酶Fig.4 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis muscle

图5　细鳞斜颌鲴肾脏组织乳酸脱氢酶Fig.5 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis kidney

3　讨论

细鳞斜颌鲴主要分布于长江水系，本研究以30尾长江水系细鳞斜颌鲴为研究对象，采用传统的鱼类度量方法，对其进行形态学研究。实验结果与乔德亮等[15]报道的梁子湖细鳞斜颌鲴生物学性状基本吻合，8个可数性状参数差异不显著(P>0.05)；与淮河细鳞斜颌鲴生物学性状不一致(表3)，侧线鳞、侧线下鳞和鳃耙数3个参数差异显著(P<0.05)，说明存在着群体差异性，环境因素可能对其形态产生影响。杨干荣[16]报道，其体长为体高的3.4～4.0倍，为头长的4.9～6.1倍，头长为吻长的3.0～4.0倍，为眼间距的2.4～2.6倍，为眼径的4.0～4.8倍，其可量性状之比与本研究一致。本研究数据可为长江水系细鳞斜颌鲴种质资源保护及种质标准的制定提供基础资料。

表3　细鳞斜颌鲴3个群体可数性状均值及标准差Tab.3　Means andstandard eviations of countable characters of three populations of Xenocypris microlepis

注：*表示与本研究相比差异显著(P<0.05)。

对鱼类的种质的评估，应结合形态特征、细胞遗传学特征和生化遗传学等特征进行研究。从细鳞斜颌鲴染色体照片和对其分析的结果，可发现在同一分裂相中最大的一对染色体的两条同源染色体属于亚中部(图2和图3)。这与李康等[17]报道银鲴等4种鲴科鱼类最大一对亚中部染色体特征相似。表明鲴科鱼类中这一对最大染色体的相对长度和臂比可能不会因罗伯逊易位、倒位、缺失或重复等改变，反映了鲴科鱼类核型的同源性。

鲴亚科鱼类染色体与鲤科鱼类染色体数目在进化上的保守性也可能相同，二倍数基本都是48，其共同的核型公式可归纳为(18～20)M+26SM+(2～4)ST，染色体臂数变化也相当保守：NF=(92～94)[18]。本研究中长江水系细鳞斜颌鲴核型公式：2N=48=20M+24SM+4ST，臂数NF=92，与报道的鲴亚科鱼类[17]在染色体分组上具有基本一致的特征。

LDH是一种催化乳酸和丙酮酸相互转化伴同发生辅酶NAD的氧化与还原的酶，存在于有机体所有组织细胞的胞质内，以肾脏含量最高。此外，鱼类肌肉活动较频繁，糖的代谢旺盛，LDH酶质量浓度较大，酶活性较高。LDH同工酶电泳图谱的特征反映了基因的活动与调控，即反映了遗传表达的本质。因此我们又针对性地研究了细鳞斜颌鲴肾脏和肌肉组织的乳酸脱氢酶的生化遗传特性。

LDH为四聚体酶，鱼类的LDH同工酶最少有3个基因编码，其中A、B基因所编码的酶出现在鱼类的多种组织中，本研究在5尾细鳞斜颌鲴肾脏与肌肉组织中检测到Ldh-A、Ldh-B基因编码的经典5种酶带，且在每种组织中LDH均为单态性，可用于种质鉴定。而在肾脏与肌肉组织中未见Ldh-C基因的表达，说明细鳞斜颌鲴LDH同工酶的遗传多样性处于中等地位。有研究认为，第3个基因所编码的酶在鲤形目中只存在于肝脏中[19-20]，细鳞斜颌鲴肝脏中也存在Ldh-C基因编码的酶带，将在另文中报道。

同一物种不同组织中LDH同工酶谱存在差异，即具有组织特异性，不同亚基组成的LDH同工酶作用不同，这一特征与该组织所处的生理条件和机能相关[19]。肌肉和肾脏中侧重于无氧酵解，LDH4与LDH5活性较高，富含A亚基，催化丙酮酸转变为乳酸及NAD+[19]，而本研究结果恰好印证了这一理论。

由于LDH同工酶数量与动物生活环境含氧量的状况相关[21]。本研究中在细鳞斜颌鲴的肌肉和肾脏组织中能检测到经典的5条酶带，数量处于中等，由此推断，细鳞斜颌鲴适宜在含氧量适中、比较稳定的水域环境中生长，这可能与细鳞斜颌鲴在水体中下层活动生活习性有关。

4　结论

通过对长江水系的细鳞斜颌鲴的形态特征和遗传学特性进行研究，发现长江水系细鳞斜颌鲴形态特征与梁子湖细鳞斜颌鲴群体生物学性状吻合，与淮河水系细鳞斜颌鲴生物学性状不一致，存在着群体差异性。长江水系细鳞斜颌鲴的体细胞染色体数为2N=48，核型公式为20M+24SM+4ST，臂数(NF)为92，未发现性染色体；其肾脏和肌肉组织乳酸脱氢酶各有5条同工酶谱带，由Ldh-A、Ldh-B两个基因编码，且肾脏LDH1～LDH2表达丰度略高于肌肉组织。本研究可为细鳞斜颌鲴种质评估及种质标准制定提供理论参考。

参考文献：

[1]孟庆闻,缪学组,愈泰济,等.鱼类学(形态、分类)[M]. 上海:上海科学技术出版社,1989.

[2]伍献文. 中国鲤科鱼类志(上卷)[M]. 上海：上海科学技术出版社,1964.

[3]杨品红,王晓艳,李梦军,等.细鳞斜颌鲴养殖技术[J].内陆水产, 2006， 31(5):45-46.

[4]江河.细鳞鲴规模化人工繁育技术[J].水生态学杂志, 2009, 2(5):149-152.

[5]刘敏,熊邦喜,吕光俊.细鳞鲴繁殖生物学初步研究[J].水生态学杂志, 2010, 3(1):76-81.

[6]鲁斌,李珺,王晓斌,等.细鳞斜颌鲴池塘主养试验[J].水产养殖, 2014, 35(11):9-10.

[7]钱华,叶飞,卜金宝.虾蟹池混养细鳞斜颌鲴的试验[J].渔业致富指南, 2008, 10(3):58-59.

[8]朱蓝菲.几种鲤科鱼类及杂种乳酸脱氢酶的比较[J].水生生物学刊, 1982, 7(4):537-545.

[9]杨品红,徐黎明,万美娇，等.细鳞斜颌鲴不同组织中LDH同工酶的比较研究[J].激光生物学报, 2009, 18(4):509-516.

[10]肖武汉,张亚平.银鲴自然群体线粒体DNA的遗传分化[J].水生生物学报, 2000, 24(1):1-10.

[11]何舜平,刘焕章,陈宜瑜,等.基于细胞色素b基因序列的鲤科鱼类系统发育研究(鱼纲: 鲤形目)[J].中国科学(C辑生命科学), 2004, 34(1):96-104．

[12]殷名称.鱼类生态学[M].北京:中国农业出版社, 1995.

[13]Tan X, Qin J G, Chen B, et al. Karyological analyses on redclaw crayfishCheraxquadricarinatus(Decapoda: Parastacidae)[J]. Aquaculture, 2004, 234(1): 65-76.

[14]李思发,赵金良,徐忠法,等.GB/T18654.13—2008养殖鱼类种质检验第13部分:同工酶电泳析[S]. 北京：中国标准出版社, 2008.

[15]乔德亮,李思发.细鳞斜颌鲴三个群体形态差异[J].生态学杂志, 2010, 29(12):2425-2430.

[16]杨干荣.湖北鱼类志[M].武汉：湖北科学技术出版社, 1986：69-70.

[17]李康,李渝成,周密,等.中国鲤科鱼类染色体组型的研究Ⅱ.鲴亚科四种鱼的染色体组型[J].动物学报, 1983, 29(3):207-213.

[18]Gold J R, Womac W D, Deal F H, et al. Cytogenetic studies in North American minnows (Cyprinidae). VII. Karyotypes of 13 species from the Southern United States[J]. Cytologia, 1981, 46(1/2): 105-115.

[19]Shaklee J B, Kepes K L, Whitt G S. Specialized lactate dehydrogenase isozymes: the molecular and genetic basis for the unique eye and liver LDHs of teleost fishes[J]. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol, 1973, 185(2): 217-240.

[20]Arai K, Yamazaki F. Developmental genetics on the lactate dehydrogenase (LDH) isozyme during early embryogenesis in salmonids[J]. Bull Fac Fish Hokkaido Univ, 1980, 31(3): 223-228.

[21]杜震宇,邵邻相.5种动物LDH和SOD同工酶的比较研究[J].华南师范大学学报(自然科学版),2002(1):117-122.