酶法提取稷山板枣多糖工艺条件优化*

杨萍芳　李　楠

（运城学院生命科学系，山西运城　044000）

板枣 （Jujube Polysaccharides）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物枣树（Ziziphus Jujuba Mil）的果实，主要产于稷山县的稷峰、化峪等丘陵地区。稷山板枣为山西十大名枣之首，果实皮薄，肉厚甘甜，核小，因果形侧面较扁，故称稷山板枣。有研究表明，板枣多糖是板枣中重要的天然活性成分，具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞的增值功能，对抗氧化，抗衰老，提高机体免疫力具有重要作用。大枣多糖的抗氧化性研究结果表明，大枣多糖样品液具有体外清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的作用，在油脂的抗氧化性方面也有良好成效。大枣营养丰富，可生食，可入药。颗粒大、色泽好的优质大枣，深受消费者欢迎，在国内外市场上畅销不衰。对于颗粒小，色泽欠佳及有伤害的劣质、残次大枣进行销售比较困难。对这类等外品红枣进行深加工提取药用成分，开发高附加值的保健品及药品，具有日益明显的优势和广阔的前景。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

稷山板枣，购自稷峰镇姚村，经自然干燥、初步挑选出优等品后留取剩余的等外品作为试验材料。经干燥箱烘干、粉碎、过筛，得板枣粉。

101A-1E电热恒温鼓风干燥箱；微型高速万能粉碎机；FA1604电子天平；HH4恒温水浴锅；722N可见分光光度计；TDL-40B离心机等。

1.2　试验方法

1.2.1　大枣多糖的提取工艺

称取干燥的板枣粉20 g，按料液比加入调好pH的去离子水溶液，添加定量的纤维素酶，于恒温水浴加热一段时间，离心取上清液。在残渣中按料液比加入去离子水，放入90℃的水浴锅中加热浸提90 min，离心后合并2次上层清液，浓缩至体积大约为初始体积的1/3时，加入4倍的无水乙醇，低温下静置3 h后离心，沉淀物在真空下干燥24 h，脱蛋白质后进行离心，取上清液浓缩，添加无水乙醇进行二次沉淀，静置后离心，沉淀物依次用丙酮、乙醚反复洗涤、离心，最后将沉淀真空干燥，称量，得到粗多糖。

1.2.2　大枣多糖含量的测定方法

以葡萄糖为标准样品，采用苯酚硫酸法测定大枣多糖的含量。

1.2.3　多糖得率的计算公式

1.2.4　单因素试验

主要研究不同料液比（A）、提取液pH（B）、纤维素酶添加量（C）、酶解温度（D）、酶解时间（E）对稷山板枣多糖得率的影响。试验因素与水平设计见表1。

表1　单因素试验因素与水平设计

1.2.5　提取工艺参数优化

以料液比、酶解温度、提取液pH为自变量，多糖得率为响应值，设计三因素三水平的中心组合试验进行响应面分析，研究各因素与多糖得率的关系。

2　结果与分析

2.1　单因素试验结果

2.1.1　料液比对大枣多糖得率的影响

料液比对大枣多糖得率的影响见图1。

图1　料液比对大枣多糖得率的影响

由图1可知，当料液比为1∶20～1∶30时，随着料液比的增大，多糖得率出现较大上升趋势。当料液比超过1∶30时，多糖得率上升幅度较小，从生产成本方面考虑，确定料液比为1∶30。

2.1.2　提取液pH对多糖得率的影响

提取液pH对多糖得率的影响见图2。

图2　提取液pH对多糖得率的影响

由图2可以看出，提取液PH在4～5范围时，随着pH的增大，多糖得率增大。当pH值大于5.0时，多糖得率开始下降，这可能是因为酶对pH的变化敏感度高，当酶反应的pH偏离了某个适宜范围，活性就会降低。因此，选择提取液的pH为5.0。

2.1.3　纤维素酶添加量对多糖得率的影响

纤维素酶添加量对多糖得率的影响见图3。

图3　酶添加量对多糖得率的影响

由图3可知，多糖得率在酶添加量少于0.05%时，随着酶添加量的增大而增大。说明随着酶量的增加，酶与底物的接触机会增大，同一时间内被酶水解的底物分子数增加。当酶添加量大于0.05%时多糖得率降低，其原因可能是纤维素酶的添加量达到一定程度时，纤维降解物大量存在，使多糖的溶解变得困难，导致多糖含量减少。因此，选择纤维素酶的适宜添加量为0.05%。

2.1.4　酶解温度对多糖得率的影响

酶解温度对多糖得率的影响见图4。

图4　酶解温度对多糖得率的影响

由图4可以看出，随着酶解温度的的增加，多糖得率升高，在50℃时达到最大。多糖得率在50℃后开始下降，可能是由于温度升高导致酶活性降低，酶促作用受到抑制。因此，选择适量的酶解温度为50℃。

2.1.5　酶解时间对多糖得率的影响

酶解时间对多糖得率的影响见图5。

图5　酶解时间对多糖得率的影响

由图5可以看出，随着酶解时间的延长，多糖得率逐渐上升。酶解时间为80 min时，多糖得率达到最大值，酶解80 min后多糖得率开始下降，其原因可能是随着酶解时间的延长，酶的稳定性受到影响，多糖也可能降解。因此，选择适宜的酶解时间为80 min。

2.2　最佳工艺条件

2.2.1　试验因素和水平

根据单因素试验结果，选取料液比（X1）、酶解温度（X2）和提取液pH值（X3）进行中心组合试验，以多糖得率（Y）为响应值进行响应面分析。响应面试验因素及水平见表2。

表2　响应面设计因素水平编码

2.2.2　二次响应面回归模型的建立与分析

大枣多糖提取工艺的优化设计试验结果见表3，方差分析见表4。

表3　响应面设计方案及试验结果

表4　响应面方差分析结果

从表4的分析结果可知，整体模型的P小于0.05，表明该二次方程模型显著。方程的失拟项小，表明该方程对试验的拟合情况好，试验误差小。因此，可用该回归方程代替试验的真实点对试验结果进行分析。3个因素对结果的影响排序为酶解温度＞料液比＞提取液pH。

对表3所得数据进行回归分析，各因素经回归拟合后，解得二次回归方程模型：Y=3.484＋1.25 X1＋1.66 X2＋0.74 X3－1.37 X1X2＋0.82 X1X2＋2.00

利用软件Design-Expert分析，给出了最优提取工艺条件：料液比为1∶30、酶解温度为55℃、提取液pH为5.19，多糖得率为3.69%。为了验证模型方程的适用性，同时考虑到操作的方便性，将上述条件调整为料液比1∶30、酶解温度为55℃、提取液pH为5.2，在此条件下进行验证，最后得到多糖得率为3.61%，接近预测值，说明试验结果与模型拟合良好，通过此模型优化能够有效提高板枣多糖的得率。

3　结论

采用酶法提取残次、等外品的稷山板枣多糖，单因素及响应面分析结果表明，最佳提取工艺条件为：料液比为1∶30、酶解温度为55℃、提取液pH为5.2，酶添加量0.05%、酶解时间80 min时，提取效果好，大枣多糖得率达到3.61%。

［1］郭艳茹，温玉洁.稷山板枣水溶性多糖提取工艺研究［J］.安徽农业科学，2010，38（35）：20 464-20 468.

［2］李小平，陈锦屏，阎雅岚.红枣多糖提取方法研究进展［J］.江西农业学报，2007，19（10）：102-104.

［3］张淮杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州：浙江大学出版社，1998.