DHPS在胃癌转移中的作用及其机制研究*

苏文雨　王吉林　熊　华　房静远

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科　上海市消化疾病研究所(200001)

胃癌在全世界常见癌症发病中排名第四，其死亡率在全世界癌症死因中排名第三[1]。胃癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的组织病理学类型和患者的临床特征均与其治疗效果密切相关，发生转移的患者预后较差。多胺是广泛存在于真核细胞中的一类低分子脂肪族阳离子化合物，是细胞生长的必需组分[2]。多胺和多胺合成酶含量在肿瘤细胞中异常升高，多胺代谢功能紊乱与癌症发生密切相关[3]。脱氧羧腐胺赖氨酸合酶(deoxy-hypusine synthase, DHPS)是多胺代谢的限速酶之一，并可催化真核生物翻译起始因子5A(eukaryotic initiation factor 5A, eIF-5A)前体的特定赖氨酸残基发生翻译后修饰[4]。目前研究认为，eIF-5A作为DHPS的底物，在调节细胞增殖、分化、凋亡等方面起有重要作用[5-6]。本课题组前期研究[7]发现，DHPS在胃癌中表达上调，并可影响胃癌细胞增殖，促进胃癌发生。本研究通过分析DHPS在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的相关性，并在体外实验中观察抑制DHPS表达和活性对胃癌细胞侵袭力和转移相关蛋白表达的影响，探讨DHPS在胃癌转移中的作用及其可能机制，旨在为胃癌的诊断、治疗和预后评估提供新的靶点。

材料与方法

一、组织芯片、细胞株和主要试剂

组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，芯片含92例胃癌组织及其相应癌旁组织，标本来源中男性42例，女性50例，年龄42～76岁，平均62.4岁，诊断均经手术标本病理结果证实，临床病理资料完整。

人胃癌细胞株MGC803购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由上海市消化疾病研究所保存。DHPS抗体(Abcam plc.)；RPMI1640培养基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；HiPerFect转染试剂(QIAGEN)；DHPS抑制剂GC7(Sigma-Aldrich Co.)；Matrigel基质胶、Transwell小室(BD Biosciences)；血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋 白酶2(MMP2)、MMP9 ELISA试剂盒(R&D Systems)。DHPS-siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计、合成，正义链序列：5’- GGA UCA AUA GGA UCG GAA ATT -3’，反义链序列：5’- UUU CCG AUC CUA UUG AUC CCG -3’。

二、方法

1. 组织芯片免疫组化染色：组织芯片以3% H2O2处理15 min以消除内源性过氧化物酶活性，以柠檬酸盐缓冲液微波加热修复抗原15 min后自然冷 却至室温；滴加非免疫性羊血清，室温封闭30 min；滴加DHPS抗体(工作浓度为1∶100)，4 ℃湿盒过夜后复温30 min，PBS漂洗3次；滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，DAB显色，苏木精复染，自然晾干后中性树胶封片。

结果判断：光学显微镜下观察细胞核呈棕褐色者为DHPS阳性细胞。随机选取5个400倍视野，计数DHPS阳性细胞，计算每视野阳性细胞均值。根据阳性细胞均值将DHPS表达强度分为0～3级：0级，0个；1级，1～5个；2级，6～15个；3级，>15个。1级为低表达，2～3级为高表达。

2. 细胞培养和干预：将MGC803细胞培养于含5%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，培养至对数生长期后，以2.0×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后进行干预。以无血清培养基清洗细胞 后，先后加入无血清培养基(2 mL/孔)以及DHPS-siRNA(5 μL/孔)或GC7(20 μL/孔)，DHPS-siRNA具体转染步骤参照HiPerFect转染试剂说明书。37 ℃培养6 h后更换为含血清RPMI1640完全培养基，继续培养24～72 h。

3. 细胞侵袭实验：取40～50 μL已稀释的基质胶加至Transwell小室膜上，37 ℃孵育4～5 h。将对数生长期MGC803细胞接种于25 cm2培养瓶(1×104/mL， 5 mL)，培养24 h后，细胞密度达70%，予DHPS-siRNA(终浓度5 nmol/L)或GC7(终浓度10 μmol/L)干预24 h，消化、重悬细胞至2.5×104/100 μL，加入Transwell小室上室；37 ℃、5% CO2、95%湿度培养箱内培养24 h后，以棉签擦拭干净上室细胞和基质胶，以PBS清洗侵袭至下室的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫常温染色30 min，PBS洗涤；将小室晾干后置于载玻片上，倒置显微镜下拍照，观察并计数穿膜细胞，每小室膜计数10个视野，计算均值。

4. ELISA法检测转移相关蛋白表达：将对数生长期MGC803细胞接种于25 cm2培养瓶(1×104/mL， 5 mL)，培养 24 h后，细胞密度达70%，予DHPS-siRNA(终浓度5 nmol/L)或GC7(终浓度10 μmol/L)干预48 h，收集细胞培养基。各组培养基加入反应板(100 μL/孔)，37 ℃孵育2 h；洗涤 4～6次，印干；反应板中加入一抗工作液(50 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；洗涤4～6次，印干；加入二抗工作液(100 μL/孔)，37 ℃孵育 30 min；洗涤4～6次，印干；加入底物工作液(100 μL/孔)，37 ℃避光孵育15 min；加入终止液(1滴/孔)，使用酶标仪读取450 nm 波长处吸光度值(A值)，以空白孔A值进行校正。根据标准品浓度和A值绘制标准曲线，查得样品VEGF、MMP2、MMP9浓度。每组设3个复孔，实验重复3次。

三、统计学分析

结　　果

一、胃癌中DHPS的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系

在92例胃癌组织中，62例(67.4%)DHPS呈高表达，DHPS表达强度与肿瘤直径、TNM分期、浸润深度密切相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、淋巴结转移和远处转移则无明显相关性(P>0.05)(表1)。

二、DHPS对胃癌细胞侵袭力的影响

分别以DHPS-siRNA和DHPS抑制剂GC7干预MGC803细胞，以细胞侵袭实验检测其侵袭力变化，结果发现与对照组相比，DHPS-siRNA和GC7均可显著下调MGC803细胞侵袭力(P<0.05)(图1、图2)。

三、DHPS对胃癌细胞转移相关蛋白的影响

分别以DHPS-siRNA和DHPS抑制剂GC7干预MGC803细胞，以ELISA法检测其转移相关蛋白表达变化，结果发现与对照组相比，DHPS-siRNA可显著 下调VEGF、MMP2和MMP9蛋白表达(P<0.05)，而GC7对这些蛋白表达的影响不明显(P>0.05)(图3、图4)。

表1胃癌组织中DHPS表达与肿瘤临床病理特征的关系

临床病理特征例数DHPS表达(n)低表达高表达P值性别0.3035 男性421626 女性501436年龄0.9054 <60岁361224 ≥60岁561838肿瘤直径0.0014 <3cm341816 ≥3cm581246TNM分期0.0169 Ⅰ期532 Ⅱ期241113 Ⅲ期551540 Ⅳ期817浸润深度0.0036 T1541 T222913 T3471532 T418216淋巴结转移0.3117 N01358 N120812 N2431330 N316412远处转移0.6309 M0842856 M1826

讨　　论

DHPS是催化eIF-5A前体特定赖氨酸残基翻译后修饰的关键因子。eIF-5A与多种肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的调控密切相关[8]，因此DHPS可能通过调节eIF-5A活性，参与调控肿瘤发生和转移[9-10]，如神经母细胞瘤发生[11]、肝细胞癌转移[12]等。本课题组前期研究[7]发现胃癌组织中DHPS mRNA和蛋白表达均明显上调。本研究进一步分析发现胃癌组织中DHPS的异常高表达与肿瘤直径、TNM分期、浸润深度显著相关，表明DHPS可能参与了胃癌的发生、发展。

转移是恶性肿瘤的主要特征，恶性肿瘤发生转移是治疗失败的主要原因。DHPS是调控肿瘤转移的重要基因之一[13]。为进一步探讨DHPS在胃癌转移中的调控机制，本研究利用DHPS-siRNA和DHPS抑制剂GC7分别对人胃癌细胞株MGC803进行干预，结果显示通过下调DHPS表达或抑制其活性均可有效减弱胃癌细胞的侵袭力。VEGF是刺激肿瘤血管生长的重要因子，MMP2和MMP9是降解细胞外基质的关键酶，三者在肿瘤侵袭 和转移过程中均起有重要作用。本研究发现以DHPS-siRNA干预MGC803细胞可致VEGF、MMP2和MMP9蛋白表达显著下调，但这些蛋白在经GC7干预的MGC803细胞中表达下调不明显，提示DHPS对胃癌转移的调控可能存在多种不同机制。

图1　DHPS-siRNA对MGC803细胞侵袭力的影响

图2　GC7对MGC803细胞侵袭力的影响

图3　DHPS-siRNA对MGC803细胞转移相关蛋白的影响

图4　GC7对MGC803细胞转移相关蛋白的影响

本课题组前期研究[7]发现，以DHPS-siRNA抑制DHPS表达可下调ERK信号通路活性，抑制胃癌细胞增殖，而本研究结果显示DHPS-siRNA可下调胃癌细胞侵袭力。鉴于ERK通路参与调控多种肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡等生物学行为，推测DHPS对胃癌转移的调控作用亦可能与ERK通路有关。DHPS活性变化可直接影响eIF-5A活化，而后者在调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化等方面起有重要作用。Muramatsu等[5]发现DHPS可通过影响eIF-5A活性，参与食管鳞状细胞癌的进展和转移。由此推测DHPS对胃癌转移的调控可能存在两条途径：一方面通过影响ERK通路，另一方面通过调节下游eIF-5A活性发挥调控作用。

综上所述，胃癌组织中DHPS表达升高，并与肿瘤浸润和进展密切相关。DHPS参与调控胃癌细胞的侵袭、转移，一方面可能是通过调节ERK通路活性影响胃癌细胞的生物学行为，另一方面则与其自身酶活性，即影响eIF-5A活性有关。随着对DHPS在胃癌转移中作用研究的进一步深入，该分子有望成为胃癌诊断和治疗的新靶点。

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