家蚕醇提物对MIN6细胞增殖及凋亡的影响※

赵淑飞 许光辉　黄亦琦　戚欢阳 马雪云 潘东明

糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，当前全球范围内糖尿病患者已高达3.87亿，预计这一数字到2030年会超过5亿。现在我国的糖尿病绝对患病人数居世界首位，糖尿病已经成为继肿瘤、心脑血管病之后对人类健康构成严重危害的第三大疾病，阐明糖尿病发病机制、开发安全有效的治疗药物刻不容缓。研究表明[1-2]2型糖尿病患者胰岛β细胞凋亡增高，胰岛素分泌功能下降。因此，保护胰岛β细胞分泌功能，减缓细胞凋亡，是抗糖尿病的关键，也是寻找抗糖尿病有效药物的基础。

家蚕治疗消渴病历史悠久，在传统中药的记载中关于家蚕治疗消渴病的介绍，如《齐民要术》 《天工开物》 《神农本草》 《中国药物》等对家蚕的药用价值均有记载，主要用于治疗小儿疳热、消瘦、消渴。现代药理研究发现[4-6]全蚕粉抑制血糖值的主要有效成分是1-脱氧野尻霉素和黄酮类化合物。全蚕粉[7]中含有三碘甲腺原氨酸（T3），蚕沙中果胶，以及全蚕粉中的蛋白质多肽、甾族激素、蚕素、蜕皮激素等物质[5，8]，可能具有不同程度调节血糖的作用。本实验中用家蚕醇提物（Silkworm alcohol Extract，SA） 作用于胰岛β细胞，旨在研究其对胰岛β细胞增殖、凋亡的影响。

1　材料

1.1药品与试剂 DMEM培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（Bi公司）；CCK-8试剂盒（Keygentech公司）；PI荧光染色试剂盒（Keygentech公司）。

1.2细胞株 小鼠胰岛β细胞瘤MIN6细胞，采用DMEM高糖培养基，临用前加青链霉素混合液、10%FBS。在37 °C，5%CO2条件下培养。

2　方法

2.1SA的制备 采集5龄3天家蚕，冻干粉碎，70%乙醇提取，得到乙醇部位，与培养基配制成0.66 g/mL的混悬液，0.22 um水系滤膜过滤，备用。

2.2CCK-8法检测SA对正常细胞增殖活性 取对数生长期的MIN6细胞，调整浓度为4×104，接种至96孔板中，加入细胞培养液以100μL/孔。培养24h细胞贴壁汇合，弃培养基，用细胞培养基稀释SA，以每孔100μL的量加入细胞，终浓度设为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL，每孔至少设3个重复孔，同时以不含SA的细胞作为空白对照组，培养12 h，每孔10μL的CCK-8溶液，37°C培养箱孵育4 h，酶标仪检测OD值，波长为450 nm。实验重复3次。

2.3H2O2诱导MIN6细胞损伤模型实验方法同2.2，MIN6细胞培养24 h贴壁后，H2O2终浓度设为0、220、440、660、880μmol/L，至少设3个重复孔，培养12 h，按CCK-8试剂盒操作方法测OD值，计算细胞存活率。实验重复3次。

2.4CCK-8法检测SA对H2O2损伤细胞的作用 实验方法同2.2，MIN6细胞加家蚕醇提物预培养12 h，设5个分组：空白组、模型组、440μmol/L H2O2+0.25 mg/mL SA组、440μmol/L H2O2+0.5 mg/mL SA组、440μmol/L H2O2+1 mg/mL SA组。至少设3个重复孔，培养12 h，按CCK-8试剂盒操作方法测OD值。实验重复3次。

2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 取生长状态好的MIN6细胞，按照常规传代方法制成单细胞悬液接种于10 cm2培养皿，约1×105/mL，每瓶加DMEM完全培养液10 mL，培养24 h细胞贴壁后，弃原培养液，磷酸盐缓冲液（PBS） 洗2次，培养基稀释成2.2所示的浓度，培养细胞24 h，同时设空白对照组；细胞密度106/mL，用0.02%胰酶进行常规消化2 min，含血清的培养液终止消化，吹打均匀，细胞悬液离心（5 min、800 rpm），弃上清，加7 mL PBS重悬细胞，制成单细胞悬液，离心；弃上清，加70%乙醇固定，与4°C冰箱过夜。弃去乙醇，加PBS至1 mL，离心；加入PBS 300μL重悬细胞沉淀，加入RNaseA（终浓度20 ug/mL） 0.6μL，37°C作用30 min；向300μL细胞悬液中，加入PI（1 mg/mL）10μL，置于4°C冰箱，避光染色30 min，即可上机检测。2.6统计学方法 采用SPSS 20.0软件包进行统计学分析，结果采用均数±标准差（x±s）表示。对于各组之间的差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1SA对正常MIN6细胞的作用 用CCK-8法检测SA对MIN6细胞增殖活性的影响，结果如表1所示。不同浓度SA作用于MIN6细胞12 h，与对照组相比，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA组MIN6细胞活性升高，且呈浓度依赖性（P<0.05）。

表1　不同浓度SA作用后胰岛MIN6细胞的增殖活性　（x±s）

3.2H2O2诱导MIN6细胞损伤模型 不同浓度H2O2诱导MIN6细胞损伤结果如表2所示。不同浓度H2O2作用于MIN6细胞12 h后，对细胞造成不同程度的损伤。浓度为440μmol/L H2O2培养细胞12 h后，计算细胞存活率（给药组/空白组×100%），存活率为60%（P<0.05），为最佳造模浓度。

表2　不同浓度H2O2诱导MIN6细胞损伤　（x±s）

3.3SA对H2O2损伤MIN6细胞的作用 SA对H2O2损伤MIN6细胞的作用，结果如表3所示。不同浓度SA+440μmol/L H2O2作用于MIN6细胞12 h后，440μmol/LH2O2+0.5 mg/mL SA组和440μmol/L H2O2+1 mg/mL SA组与模型组相比对MIN6细胞有保护作用（P<0.05）。0.25 mg/mL+H2O2SA组与模型组相比，差异无统计学意义。

表3　不同浓度SA对H2O2损伤MIN6细胞的保护作用 （x±s）

3.4SA对MIN6细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，与对照组比较，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA组MIN6细胞凋亡率呈减少趋势（P<0.05）；0.25 mg/mLSA组与正常组比较差异无统计学意义。结果见表4。

表4　不同浓度SA作用后胰岛MIN6细胞的凋亡率　（x±s）

4　讨论

胰岛β细胞在糖尿病的发生发展中起着十分重要的作用[9]，胰岛β细胞功能损害是糖尿病的主要病理机制之一。尽管胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的始动因素，但β细胞功能受损是2型糖尿病的决定因素[10]。本实验用不同浓度的SA（0、0.25、0.5、1 mg/mL） 干预胰岛 MIN6细胞12 h，发现与对照组比较，0.5 mg/mL和1 mg/mL SA组MIN6细胞增殖活性增高（P<0.05），细胞凋亡率减低（P<0.05），且呈剂量依赖性；440μmol/L H2O2诱导MIN 6细胞损伤12 h，细胞存活率为60%，为最佳造模浓度。0.5 mg/mL和1 mg/mL SA对H2O2诱导MIN 6细胞损伤有保护作用。

本实验结果提示适宜剂量的SA可以通过促进胰岛β细胞增殖，抑制其凋亡，进而改善胰岛β细胞功能，对糖尿病的防治有积极作用；此实验探讨了SA对胰岛β细胞的影响，其机制正在进一步研究中，考虑与AKT及其下游信号传导通路有关。因此，进一步探讨SA的作用机制及临床疗效，对中西医联合治疗糖尿病有着重要意义。

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