anti-Livin核苷酸调低喉鳞癌裸鼠移植瘤内Livin的表达对喉鳞癌细胞凋亡的影响

冯　俊,李　丽,杨久梅,彭　涛

(1川北医学院第二临床医学院耳鼻咽喉科,南充　637007;2川北医学院病理教研室;*通讯作者,E-mail:fjlx8888@163.com)

喉癌是耳鼻咽喉科常见病、多发病,最常见的病理类型为高分化鳞状细胞癌,随着环境污染加剧其发病率呈逐年升高的趋势,占头颈恶性肿瘤的第三位,已成为严重危害人类生命健康的头颈恶性肿瘤之一[1]。由于晚期的喉癌病人失去了手术机会,以及喉鳞癌对放射治疗、药物化疗不敏感,临床中迫切需要新的治疗方法来延长病人的生命。随着技术的发展,基因治疗成为晚期肿瘤患者的选择之一。anti-Livin核苷酸在体外能抑制喉鳞状细胞癌中Livin的表达[17]。Livin(IAPs,inhibitor of a apoptosis protein)是凋亡抑制蛋白家族中的成员之一,与肿瘤细胞凋亡有关[2,3]。本研究利用anti-Livin核苷酸调低喉鳞癌裸鼠移植瘤内Livin的表达量,探讨其对喉鳞癌细胞凋亡的影响。

1　材料和方法

1.1　裸鼠及细胞系

雌性裸鼠(BALB/c-nu/nu)28只,2-3周龄,体重20-22 g,购于四川大学华西动物中心,生产许可证:SCXK(川)2013-026。Hep-2细胞株由川北医学院分子生物研究所赠送。

1.2　主要试剂

RPMI-1640(按说明书配制,含HEPES 25 mmol/L,谷胺酞胺2 mmol/L,直径0.22 μm滤器过滤除菌,临用前加入10%新鲜灭活的胎牛血清,青霉素100 U/ml,链霉素100 μg/ml),Lipofectamine 2000、GAPDH monoclonal antibody购自美国Santa Cruz公司;Livin单克隆抗体购自中国Takara公司,TUNEL试剂盒购自美国Roche公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;BCIP/NBT购自中国Takara公司。

1.3　多核苷酸目标序列设计及多核苷酸的合成

Livin基因序列(序列号:NM-022161)于NCBIGenBank库获得,根据干扰分子生物学原理,设计、筛选出3个以上有效靶点序列,选取干扰效率高的进行实验。最优靶点序列为BIRC7-SH2:Sen-DNs(正义Livin核苷酸):5′-GCCCTGTCCTAGGCCTGGACA-3′;AS-DNs(反义Livin核苷酸):5′-TGTCCAGGCCTAGGACAGGGC-3′;Mis-DNs(错配Livin核苷酸):5′-CAGATGTAGACCATCAGTCTA-GAAC-3′;核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4　裸鼠饲养及移植瘤成模

于SPF级无菌室饲养裸鼠,室内定期消毒灭菌。于Hep-2细胞生长达70%-80%时,用0.25%胰酶消化、PBS混悬,制成1×105/ml瘤细胞悬液3-4 ml,放在37 ℃,5% CO2孵箱备用;采用碘伏在裸鼠背侧部消毒,皮下注射Hep-2细胞悬液0.1 ml(约含细胞1×105个);裸鼠于SPF级无菌室继续饲养,观察裸鼠皮肤颜色变化、进饲情况、活动规律变化等生理指标。测量肿瘤长径和短径变化,按公式肿瘤体积=(长径×短径2)π/6计算,将肿瘤体积变化绘制成生长曲线。约接种后7 d,肿瘤体积长到200 mm3时,分为4组:对照组、Sen-DNs组、Mis-DNs组和AS-DNs组,每组7只。采用裸鼠移植瘤体内分组注射不同药物。AS-DNs组:每只裸鼠移植瘤内注射2.5 mg/kg的Livin AS-DNs悬液0.1 ml;Sen-DNs组:每只裸鼠移植瘤内注射2.5 mg/kg的Livin Sen-DNs悬液0.1 ml;Mis-DNs组:每只裸鼠移植瘤内注射2.5 mg/kg的Livin Mis-DNs悬液0.1 ml;对照组:每只裸鼠移植瘤内注射0.1 ml生理盐水;每次多点注射,每次间隔时间为5 d,再次取不同部位注射,共3次。末次注射后第3周,乙醚麻醉后断颈处死,取移植瘤液氮保存备用。

1.5　Western blot分析瘤体中Livin蛋白的表达

将1.4所述各组瘤体组织分别集中匀浆后将匀浆物转移到离心管,4 ℃离心5 min,收集上清液,再次离心,取上清,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,弃沉淀,煮沸样品10-15 min,离心5 min,共离心3次,以Bradford法检测上清液的蛋白浓度调整上清液体积,PVDF膜正反面作标记,用PBS(含3%脱脂奶)封闭液,在室温下封闭6-8 h,PBS液清洗10 min×3次。加一抗Livin单克隆抗体(1 ∶500),加GAPDH(1 ∶3 000),常温培育1.5 h,PBST洗涤4次,每次15 min,加HRP标记的二抗,常温培育1 h,用15 ml TBS清洗1次,过15 min,再用15 ml TBS洗4次,每次清洗5 min。加入BCIP/NBT试剂显色、室温培育2 min。暗室胶片显影、定影、扫描。

1.6　TUNEL法分析移植瘤细胞凋亡

常规石蜡切片4 μm,用3% H2O2室温反应30 min,PBS洗3 min×3次,4%多聚甲醛溶液,室温放置15 min,PBS洗2次。100 μl 20 μg/ml的蛋白酶K以覆盖组织切片,室温孵育20 min,PBS洗3 min×3次。TUNEL混合液1 ml,37 ℃培育1 h,PBS洗3 min×3次,抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶液(Streptavidin-HRP)100 μl,在37 ℃培育30 min,0.04% DAB+0.3%H2O2显色约10 min,苏木精复染1 min。计算AI(apoptotic index):AI(%)=凋亡细胞数/总的有核细胞数。

1.7　统计学分析

2　结果

2.1　移植瘤内Livin蛋白相对含量变化情况

由图1可见,AS-DNs组的Livin蛋白相对表达量最低[(15.02±1.68)%],Mis-DNs组、Sen-DNs组、Control组的Livin蛋白相对表达量分别为(54.56±2.45)%、(52.60±1.85)%、(55.51±2.92)%;AS-DNs组与Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control Livin蛋白比较差异有统计学意义(P<0.05)。Mis-DNs、Control、Sen-DNs组两两之间差异无统计学意义。

与其他三组比较，*P<0.05图1　各组移植瘤中Livin蛋白的表达量Figure 1　The Livin protein relative quantity in transplanted tumor in vivo was detected by Western blott.

2.2　不同组裸鼠移植瘤细胞凋亡分析

用TUNEL法检测不同组移植瘤细胞凋亡情况,结果显示AS-DNs组瘤体组织细胞内见大量含凋亡小体的细胞,Mis-DNs组、Sen-DNs组、Control组瘤体内见少量含凋亡小体的细胞(见图2);Mis-DNs组、Sen-DNs组、Control组的凋亡指数分别为(4.33±1.52)%、(6.21±2.1)%和(5.01±2.1)%,三者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。AS-DNs组裸鼠移植瘤体内喉鳞癌细胞的凋亡指数最高为(20.15±3.1)%,与Mis-DNs组、Sen-DNs组、Control组比较差异有统计学意义(见图2)。

2.3　不同作用下喉鳞癌细胞移植瘤的生长曲线变化

采用AS-DNs治疗组的肿瘤曲线斜率较小,曲线较平坦,肿瘤细胞生长缓慢;Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control组肿瘤曲线斜率较大,曲线较陡,肿瘤细胞生长较快(见图3);AS组与Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Mis-DNs组、Sen-DNs组、Control组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

Livin是常见与细胞凋亡有关的基因,属于凋亡抑制蛋白家族中的一员,其基因位于人类第20号染色体,共46 kb。Livin蛋白由BIR结构的N端,及RING结构C端构成,其活性区是BIR区,与Livin蛋白表达、细胞的凋亡相关[4-6]。Livin抑制细胞凋亡的机制主要是:通过激活TAKI/JNK1信号转导途径抗凋亡;抑制caspase途径:Livin能与caspase前体蛋白和其激活形式结合从而抑制其功能,阻断其级联反应从而抑制凋亡的进程,阻碍多种途径诱导细胞死亡[7-9]。Yang等[10]通过siRNA抑制膀胱癌T24细胞Livin蛋白的表达,从而促进T24细胞生长抑制及凋亡。Livin基因还在乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、黑色素瘤、肺癌组织、结肠癌组织中有表达[11-16]。Feng等[17]研究显示在喉鳞癌细胞中可检测到Livin mRNA的高表达,通过抑制Livin的表达,在体外促进了喉鳞癌细胞的凋亡。Ge等[18]研究提示Livin在大肠癌中高表达,并且通过NF-κB活化诱导上皮间质转化促进大肠癌细胞的迁移和侵袭。

与其他三组比较，*P<0.05图2　各组移植瘤细胞凋亡情况Figure 2　The apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma cell in different group by TUNELs

图3　不同干预下喉鳞癌细胞移植瘤的生长曲线变化Figure 3　Growth curve of transplant tumor of Hep-2 cells after different treatment

本研究显示,用Western blot分析各组移植瘤的Livin蛋白时,AS组的Livin蛋白表达量较低[(15.02±1.68)%],这可能是由于反义Livin多核苷酸抑制了Livin的表达,进而促使裸鼠移植瘤细胞mRNA、Livin蛋白的降低;而Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control组的Livin蛋白表达量较高,这可能是由于Sen-DNs组、Mis-DNs组多核苷酸对Livin无抑制作用,故AS-DNs组Livin蛋白与Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control组间比较,差异有统计学意义。Sen-DNs组、Control组、Mis-DNs组间两两比较,Livin蛋白无显著差异。本研究揭示anti-Livin核苷酸在裸鼠移植瘤内可以减少Livin蛋白表达,与Feng等[13]的体外实验吻合。AS-DNs组瘤体组织细胞内见大量含凋亡小体的细胞,提示组织细胞内出现大量凋亡,而其他组瘤体内见少量凋亡小体的细胞;Livin AS-DNs组的凋亡指数显著高于其他组,提示AS-DNs能促进喉鳞癌细胞凋亡。而采用AS-DNs治疗组的肿瘤生长较Sen-DNs组、Mis-DNs组、Control组慢,可能是反义Livin多核苷酸促进喉鳞癌细胞凋亡从而对肿瘤的生长有显著抑制作用。动物实验显示anti-Livin核苷酸促进了裸鼠移植瘤喉癌细胞的凋亡。

本研究结果表明,反义Livin多核苷酸能调低喉鳞癌组织中Livin表达,在裸鼠移植瘤内增加喉鳞癌细胞的凋亡,抑制了肿瘤的生长。为将潜在的基因治疗运用于喉鳞癌病人提供依据,这一方法亦可能潜在用于临床其他肿瘤的研究和治疗。

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