基于COⅠ基因的美国白蛾与近似种类分子检测技术研究

钱　路，马丽娜 ，吴　晶 ，李　健 ，安榆林 ，郝德君

（1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.常州出入境检验检疫局，江苏 常州213001；3.南京出入境检验检疫局，江苏 南京 211106；4.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210000）

美国白蛾Hyphantria cunea是一种食性广、危害大的世界性检疫害虫。原产北美，传入并广泛分布于南美洲大部分地区[1]。其成虫具有趋光性，可飞行380多米，可随货物及交通工具的运输进行远距离扩散[2]。美国白蛾于1940年传入欧洲，先后侵入匈牙利、罗马尼亚、保加利亚、奥地利、原苏联、波兰和法国，并于1945年后先后传入日本、韩国、朝鲜。1979年从辽宁丹东传入我国后，先后扩散至陕西、河北、北京、天津、河南、山东、安徽和江苏等省市，造成重大经济损失和生态环境的破坏[3-4]。由于美国白蛾具有食性杂、食量大、繁殖能力强、适生性广、传播速度快、危害严重等特点，已经成为我国最具危险性的外来入侵物种之一，被国家林业局列为全国林业检疫性有害生物[5]。因此，严格防控美国白蛾已成为维护我国生态安全和林木资源的重要任务。

美国白蛾与杨毒蛾Leuoma candida、榆毒蛾Lvela ochropoda、星白雪灯蛾Spilosoma menthastri、稀点雪灯蛾Spilosoma urticae和白雪灯蛾Spilosoma niveus等种类不仅成虫的体色和形态上非常相似，不易鉴别，而且卵、幼虫、蛹也难以区分。由于美国白蛾的成虫、幼虫和蛹等不同虫态均可随果品及包装材料远距离传播扩散，出入境口岸截获后仅仅依赖于传统的形态学方法很难做出快速准确的识别和鉴定。而相比形态分类学方法，近些年发展起来的DNA条形码(DNA barcode) 检测技术简便易操作、快速且准确率高，因而在生物分类学、系统发育学等遗传分析研究中的应用日渐增多[7-9]。其中线粒体DNA由于具有提取技术简单、母系遗传、无重组、单拷贝、进化速率较核基因快等特点，常被选做DNA条形码技术中的分子标记[10-11]。线粒体细胞色素氧化酶 C 亚基Ⅰ( mt DNACOⅠ) 基因是目前背景研究最为清楚的基因之一，其结构相对保守但种间变异较大，能够提供较全的系统发育信息，在昆虫近缘种间的系统进化研究及分类鉴定等方面都有较广泛的应用，也为出入境检疫部门快速、准确地检疫鉴定截获的昆虫提供了新方法[12-15]。

关于分子标记技术如AFLP、RAPD和微卫星位点等方法在美国白蛾的种群遗传结构方面已有研究[16-19]，但是利用分子标记方法比较分析美国白蛾与近缘种或相似种的种间鉴定技术的研究尚未见报道。因此，本研究以美国白蛾及其形态相似的8种蛾类的COⅠ基因为模板，设计美国白蛾特异性荧光探针，建立快速、高效、可靠的美国白蛾快速分子鉴定技术，以期可以对成虫、蛹、幼虫和卵不同虫态实现快速、准确的鉴定效果，为出入境口岸和森防部门检疫、监测美国白蛾具有十分重要的实践意义。

1　材料与方法

1.1　供试虫源

本实验选取了美国白蛾及其形态近似的8种蛾类，虫样形态特征见图1。该实验虫样分别采自安徽、江苏、浙江、河北等地，具体信息见表1。虫样保存于5 mL离心管中，用无水乙醇浸泡，于－20 ℃冰箱保存，供实验用。

图1　虫样的形态Fig.1　The morphologic pictures of sample insect

1.2　实验方法

1.2.1　总DNA提取

样品DNA的提取采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA 磁珠提取试剂盒。

1.2.2　PCR引物

参考Herbert的研究，用通用引物LepF1和LepR1[19]对供试样本进行PCR反应扩增COⅠ基因并测序。具体见表2。

表1　实验用虫样信息Table 1　Information of insect in experiment

表2　PCR扩增所用到的引物Table 2 The primers of polymerase chain reaction (PCR)

1.2.3　PCR扩增COⅠ基因片段

在PCR仪(Epgradient S)上以25 μL的体系：2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，1 U Taq DNA polymerase，0.5 μL LepF1/LepR1（Genscript）进行扩增，虫样的总DNA模板1 μL，后加dd H2O至终体积25 μL。反应条件为：94 ℃ 1 min， 5个循环的预扩增（94 ℃40 s，45 ℃ 0 s，72 ℃ 1 min）加 35 个循环（94 ℃40 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min），最后在 72 ℃下延伸5 min。

取5 μL PCR产物，采用1.5 %凝胶电泳分析检测（Agarose gel electrophoresis）。将含有目的条带的PCR产物直接送到南京金斯瑞有限公司双向测序。

1.2.4　美国白蛾COⅠ基因特异性引物设计

根据测序比对结果，找出美国白蛾的特异性碱基位点，设计美国白蛾特异性引物HC-F和HC-R（500 nmol/L），引物序列见表3。

表3　美国白蛾特异性引物Table 3 The specific primers of Hyphantria cunea

在引物HC-F和HC-R扩增片段之间再寻找美国白蛾的特意碱基位点设计MGB探针，探针的核酸序列为AAGTATGGTAATAGCTC，5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团NFQ，浓度为250 nmol/L。

引物HC-F、HC-R和MGB探针在COⅠ基因上的大致位置见图2。

图2　特异性引物探针位置Fig.2　Location sketch map of speci fic primer probe

1.2.5　实时荧光PCR

PCR反应体系（20 μL）：0.5 U Taq DNA polymerase ，2 μL 模板 DNA，10 μL TaqMan mix，从100 nmol/ L ～ 1 000 nmol/ L以50 nmol/ L递增的引物HC-F/HC-R及浓度从50 nmol/L ～500 nmol/L以25 nmol/ L递增的MGB探针，对引物和探针浓度进行不同的配比试验。根据Ct值和曲线形态，确定最佳浓度以及配比。

针对ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，对退火温度、循环参数进行了优化试验，以期达到最佳扩增效率。

2　结果与分析

2.1　美国白蛾与近似种COⅠ基因的获得

用通用引物LepF1和LepR1[9]对供试样本进行PCR反应，扩增产物的电泳图如图3。从图3可以看出，各供试样本PCR产物在700 bp左右均有条带出现。将美国白蛾PCR产物测序结果与NCBI上的序列进行比对，相似度达100%，说明本方法的PCR产物确实为美国白蛾的COⅠ序列。

图3　美国白蛾及其近似种样品PCR扩增产物的电泳（部分样品）Fig.3　Ampli fication of PCR product about Hyphantria cunea and other allied species

用MEGA7.0软件对测序获得的美国白蛾COⅠ和其他近源种的COⅠ进行构建进化树分析，1 000次重复结果，分析无误的序列上传至Genbank，见图4。结果表明，从不同地区采集的美国白蛾Hyphantria cunea位于进化树同一分支上，说明它们来自于相同的祖先。进化树分析表明净雪灯蛾Spilosoma album和净污灯蛾Spilarctia album位于同一分支上，作者分析认为净雪灯蛾和净污灯蛾可能是同物异名。另外，进化树结果显示来自不同地区的相同物种（人纹污灯蛾、八点灰灯蛾、红缘灯蛾和杨雪毒蛾）均能分别聚集到同一分支，说明地域的差异并没有引起他们COⅠ基因的改变，显示出其在进化上的保守性。

2.2　美国白蛾COⅠ基因实时荧光PCR体系的建立

反应体系最终确定为：总体系20 μL，各组分加入量分别为：TaqMan mix 混合反应液10 µl，上游引物HC-F为0.5 μL，下游引物HC-R为0.5 μL，MGB 探针为 0.25 μL，模板 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL (5 U/μL)，加 ddH2O 补足到 20 μL。反应程序为：50 ℃ 2 min，95 ℃预变性10 min；进入循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共 40个循环。

结果见图5，美国白蛾的4个样本都出现了荧光信号，而杨雪毒蛾、红缘灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净污灯蛾、星白雪灯蛾、白雪灯蛾的DNA扩增产物没有荧光信号，表明该引物探针和荧光PCR方法能够对美国白蛾进行特异性的扩增。

图4　邻接法基于COⅠ基因构建的美国白蛾及近似种系统发育树Fig.4　Neighbor-joining phylogenetic tree of COⅠgene of Hyphantria cunea and other allied species

图5　实时荧光PCR特异检测美国白蛾荧光Fig.5　Fluorescence diagram of Hyphantria cunea by qRT-PCR

2.3　美国白蛾COⅠ基因荧光PCR循环参数的优化

采用实时荧光PCR检测其灵敏度，具体结果见图6。美国白蛾的所有测试浓度都出现荧光检测信号，Ct值与DNA模板浓度相关。模板浓度为2.5 ng/μL、0.25 ng/μL、25 pg/μL、2.5 pg/μL、0.25 pg/μL时，扩增的Ct值分别为18.1，21.8，25.4，29.2，32.8。在0.25 pg/μL的浓度下荧光PCR扩增曲线明显，两个平行样间的Ct值分别为33.1和32.7，体现了良好重复性，表明该方法的检测下限在0.25 pg/μL以下。上述结果说明，采用引物HC-F/HC-R和探针HC-TZ能够对0.25 pg/μL以上浓度的样本进行稳定的扩增，重复性实验结果相一致，表明采用上述引物和探针对美国白蛾的检测灵敏度为 0.25 pg/μL。

图6　实时荧光PCR检测美国白蛾的灵敏度结果Fig.6　Sensitivity analysis of Hyphantria cunea by qRT-PCR

3　小结和讨论

基因克隆以及分子标记等技术是开展入侵遗传学、昆虫毒理等研究必不可少的手段之一，其在昆虫的分类学、系统学、种群动态与遗传关系、入侵等分析中起到了重要的作用。毛珊珊等[20]利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法扩增松墨天牛ERP基因，并结合实时荧光定量PCR的方法研究了其防御相关机制，揭示了其免疫与分子毒理之间的相互作用。此外昆虫基因组研究中，高效的多态性分子标记技术应用越来越多，如随机扩增多态性DNA（RAPDs）、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星等；另外可以利用单核苷酸多态性（SNPs）的分子标记技术检测基因中保守的遗传变异情况[21]。DNA条形码技术由于具有简便、准确、高效的特点，因此在昆虫鉴定中的作用日渐加强，目前许多国家将DNA条形码技术应用到外来物种的鉴定之中[22-23]。而其中基于COⅠ基因的DNA条形码鉴定技术应用更加广泛，尤其在形态学难以鉴定的蚧虫、实蝇、小蠹虫、舞毒蛾等分类中的应用较多[24-26]，解决了非成虫虫态、复合种、隐存种、近缘近似种、不同地理种等鉴定疑难问题，为重大的检疫性害虫的鉴定监测提供了技术支持。

本研究通过生物信息学分析和PCR技术测定了美国白蛾及星白雪灯蛾、白雪灯蛾、杨雪毒蛾、红缘灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净污灯蛾等8个近似种的线粒体COⅠ基因片段，进行了DNA条形码比较分析，并构建系统发生树。结果显示除了净雪灯蛾、净污灯蛾外，其它DNA条码都为各物种所独有，不存在物种之间的共享，提示该条码在美国白蛾及其近似种中有很好的识别能力，可以用于美国白蛾的物种鉴定。DNA条码也为净雪灯蛾和净污灯蛾为同物异名提供了分子证据。同时筛选得到美国白蛾的特异性DNA序列，并以此设计出针对美国白蛾快速鉴定的MGB探针，应用荧光PCR方法能够对美国白蛾进行特异性的扩增。本项目的研究结果为美国白蛾的口岸检疫鉴定、森防部门的监测和除治提供了新型技术手段。

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