P5CR基因的进化及其在木薯中的表达分析

丁泽红 付莉莉 颜彦 铁韦韦 胡伟

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科热带和亚热带地区重要的薯类作物，具有高产、高淀粉和耐贫瘠等特点，在现代工业和农业中起着非常重要的作用。木薯具有发达的根系，可以忍受长达4-6个月的干旱胁迫［1］。然而，在这种长时间（或较为严重）的干旱胁迫条件下，木薯的生长和发育受到显著了的影响，最终导致其块根产量减少［2］。作为典型的热带块根作物，木薯主要种植在南北纬30°之间的热带和亚热带地区。木薯对温度非常敏感，低于14℃时木薯生长会明显变缓，低于10℃时木薯将停止生长。更为严重的是，在极端的低温天气下木薯块根产量会急剧下降甚至绝收［3］。因此，提高木薯抵御干旱和低温等胁迫的抗性，对减少木薯在不良生长环境下的产量损失具有重要指导意义。

脯氨酸是重要的渗透调节物质，在植物体内起着调节细胞渗透平衡、维持细胞结构稳定和清除活性氧等作用［4］。在干旱、低温、高盐等胁迫条件下，植物体内脯氨酸含量会显著增加［5-6］，其含量和植物的抗逆性呈正相关［7］。植物脯氨酸合成途径可以分为两种：鸟氨酸途径和谷氨酸途径。有趣地是，这两种途径的最后一步反应相同，均由吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）催化完成，可见P5CR是脯氨酸生物合成途径的关键酶，由其催化的反应对植物生长可能至关重要，例如在拟南芥中敲除P5CR后可引起植株胚胎致死［8］。此外，在植物中超表达P5CR后，转基因植株在胁迫条件下脯氨酸含量显著增加，其抗逆性显著增强［9］。

大多数植物中P5CR仅由1个基因编码，它们在进化过程中比较保守，属于看家基因（Housekeeping genes）［10］。P5CR的表达在不同组织中存在显著差异。例如，拟南芥中AtP5CR在根中表达量最高，其次是果荚、花和叶，而茎中的表达量最低［11］。P5CR的表达还受到干旱、低温、盐和ABA等的诱导。例如，拟南芥AtP5CR的表达量受到低温、高温和盐胁迫的诱导［12-13］；黑麦草LpP5CR的表达受到盐、PEG（Polyethylene glycol）、低温和ABA（Abscisic acid）处理的诱导［14］；而小麦TaP5CR的表达则受到盐、PEG和ABA处理的诱导［9］。这些研究成果为在其他植物中挖掘和鉴定P5CR的功能奠定了重要基础。

迄今为止，在木薯中已经克隆了一个P5CR，其表达在转录水平受到渗透胁迫的调控［6］。然而，在木薯中是否还存在其他的P5CR，它们和其他植物中P5CR的进化关系如何以及它们是否参与了木薯干旱、低温等胁迫响应，仍不清楚。本研究拟采用生物信息学的方法从已完成基因组测序的植物中鉴定P5CR，并对其序列特征和进化模式进行分析；之后主要针对木薯MeP5CR，分析其在不同组织以及干旱、低温等胁迫条件下的表达模式，旨在为进一步研究MeP5CR在木薯非生物胁迫中的功能奠定基础，同时也为其他植物中P5CR的功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用木薯材料为主推广品种Ku50，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料种植与处理 参照丁泽红等［15］方法进行木薯种植：将具有3-4个芽眼且粗细匀称的木薯茎段（长度约15 cm）扦插于塑料盆（高×上直径×下直径 = 18.8 cm×18.5 cm×14.8 cm）中，每盆1个茎段。基质采用蛭石与营养土按照1:1的体积比进行混合。木薯种植约10 d后进行间苗，每盆保留1棵苗。

木薯种植60 d后，选取长势一致植株分别进行（1）干旱处理：采用20%的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，在处理0、3和24 h后，分别收集老叶、第一片完全展开叶、未展开叶和根的样品，-80℃保存待用；（2）低温处理：采用4℃进行低温胁迫处理，在0、6和24 h后分别收集第一片完全展开叶、未展开叶和根的样品，-80℃保存待用。

为考察MeP5CR在不同组织中的表达变化，收集正常种植条件下木薯Ku50的叶片、叶柄、茎、须根和储藏根的样本，进行qRT-PCR分析。

1.2.2 RNA提取与qRT-PCR 用天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒提取木薯总RNA。用Fermentas公司反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，-20℃保存待用。用Primer 6.0设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。qRTPCR在Mx 3005P荧光定量PCR仪（Stratagene，美国）上进行，每个样品3次生物学重复，按照2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量［6］。

1.2.3 生物信息学分析 以拟南芥［16］、水稻［17］中P5CR的蛋白质序列为参考，用BLASTP搜索Phytozome数据库获取其他物种的P5CR同源序列。在去除冗余序列之后，用NCBI-CDD数据库进行保守结构域分析，确保每条序列都含有P5CR保守结构域。之后，用ClustalX进行序列比对；用MEGA5.2构建Neighbor-Joining系统进化树；用ExPASy ProtParam分析蛋白质的分子量和等电点。

表1 qRT-PCR引物

2 结果

2.1 P5CR在不同物种中的分布

以拟南芥和水稻中P5CR为查询序列，搜索Phytozome数据库，在45个物种中共找到54条P5CR序列，其中苹果P5CR数目最多，为3个，其次是柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亚麻、大豆，为2个，在主要单子叶植物（如水稻、玉米、小米、高粱等）和双子叶植物（如拟南芥及其近缘种鼠耳芥等）中有且仅有1个P5CR（图1和表2）。木薯与杞柳、毛果杨亲缘关系较近，它们仅有1个P5CR。除此之外，在许多低等生物如团藻、莱菌衣藻、盐生杜氏藻、小立碗藓和泥炭藓中也只有1个P5CR（图1）。

序列特征分析表明，P5CR平均氨基酸长度为282.6，最大值为347，最小值为208；平均外显子数目为7.2，最大值为9，最小值为6（表2）。P5CR的分子量和等电点在不同物种之间的差别不大。相比之下，P5CR长度的最大值为9 797 bp，最小值为1 174 bp，两者相差9倍之多（表2）。可见，P5CR在基因长度上差别较大，且这种差异主要是由内含子长度上的差异造成的。

图1 P5CR基因在不同物种中的分布

2.2 P5CR进化分析

将54条P5CR氨基酸序列进行比对、聚类后发现，它们可以分成12个主要组群（图2）。其中，木薯与巨桉中P5CR的亲缘关系较近，聚类在一起（图2-K）。可以清楚的看到，各物种中P5CR的亲缘关系与物种之间的进化关系呈现很好的一致性：低

等藻类和藓类植物（如团藻、莱菌衣藻、泥炭藓和小立碗藓等）都聚类在A组，单子叶植物（如水稻、高粱、玉米和二穗短柄草等）都聚类在B组，双子叶植物（如拟南芥、琴叶拟南芥和鼠耳芥等）都聚类在D组，豆科植物（如大豆、菜豆和蒺藜苜蓿等）都聚类在L组，且大多数植物中都只有1个P5CR（图2）。不同组群之间P5CR长度的统计结果显示，除了个别组群中P5CR的长度要显著的低于或高于其他组群，如D组（双子叶植物）中P5CR长度最小（～1 600 bp）、F组（茄科植物）和J组（可可和雷蒙德氏棉）中P5CR长度最大（＞6 000 bp），大多数组群中P5CR的长度都保持在4 000 bp左右，差异不显著（图3）。结果表明，P5CR在各物种之间非常保守，且是单基因起源的。

表2 本研究中鉴定到的P5CR

续表

在少数物种中P5CR仍发生了2-3次重复，并可以将它们归纳成3种进化模式。模式I：种内进化模式，即只在两近缘物种中的某一物种发生重复。例如，大豆和菜豆都属于豆科植物，亲缘关系较近，大豆中有2个P5CR（GmP5CR1和GmP5CR2），而菜豆中只有1个P5CR（PvP5CR），且它们聚类在一起（图2-L）；模式Ⅱ：种间进化模式，即在两近缘物种中均发生重复。例如，卷心菜和白菜型油菜都属于芸苔属植物，亲缘关系较近，卷心菜和白菜型油菜中均有2个P5CR，且卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2分别和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2聚类在一起（图2-D）；模式Ⅲ：种间与种内进化模式共存。巴旦木和苹果亲缘关系较近，本研究发现巴旦木PpeP5CR1和苹果MdP5CR1、MdP5CR3聚类在一起（图2-C），而巴旦木PpeP5CR2和苹果MdP5CR2聚类在一起（图2-H）。以上结果表明，P5CR呈现多样性的进化模式。

2.3 MeP5CR在不同组织中的表达情况

采用qRT-PCR方法检测MeP5CR在木薯不同组织中的表达情况。结果（图4）表明，MeP5CR在叶片、须根和储藏根中表达量最高，且三者之间的表达量无显著差异；MeP5CR在叶柄和茎中的表达量最低，仅是叶片中表达量的48%和51%。说明MeP5CR主要是在木薯叶片、须根和储藏根中起作用。

2.4 MeP5CR对干旱和低温胁迫的响应

采用qRT-PCR方法在木薯不同叶片（如第一片完全展开叶、未展开叶及老叶）和根中，分别检测MeP5CR对干旱（PEG模拟）和低温胁迫的响应情况。在PEG胁迫条件下，在老叶中MeP5CR呈现先不变后下降的变化趋势，在24 h其表达量显著下降约36%；在第一片完全展开叶MeP5CR呈现先下降后上升的变化趋势，在3 h和24 h其表达量分别下降20%和提高1.3倍；在未展开叶和根中，MeP5CR呈现持续下降的变化趋势，在24 h其表达量分别下降23%和9%（图5-A）。

在低温胁迫条件下，在未展开叶中MeP5CR的表达量呈现先上升后下降的变化趋势，在6 h其表达量提高3.7倍，在24 h其表达量又回复到初始水平；在根中MeP5CR的表达量也呈现先上升后下降的变化趋势，在6 h和24 h其表达量分别提高1.9倍和下降59%；在第一片完全展开叶中，MeP5CR的表达量呈现持续上升的变化趋势，在6和24 h其表达量分别提高3.4倍和5.9倍（图5-B）。

综上所述，MeP5CR在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫响应。

图2 植物中P5CR的进化树分析

图3 不同组群中P5CR长度的变化

图4 MeP5CR在不同组织中的表达

3 讨论

P5CR属于看家基因，在大多数植物中有且仅有1个拷贝［10］。尽管目前已陆续从拟南芥、水稻、黑麦草、木薯等植物中克隆了P5CR［6，14，17］，但这些研究仅关注于少数几个物种的P5CR亲缘关系，无法全面系统地了解P5CR的进化历史。本研究采用生物信息学方法，从已经完成基因组测序的45个植物中共鉴定出54条P5CR序列，并考察了它们在不同植物中的分布情况（图1）。结果表明，在主要农作物（水稻、玉米、小米、高粱）和模式植物拟南芥中都仅有1个P5CR，与前人研究结果一致［10］。在木薯中也只有1个P5CR成员。与前人报道不同的是，本研究发现至少在8种植物（包括苹果、柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亚麻、大豆）中存在2-3个P5CR（图1），暗示P5CR在这些植物中存在不一样的进化过程。序列特征分析表明，各植物中P5CR的氨基酸长度、分子量大小、和外显子数目相差不大，但基因长度的变化幅度非常大。进一步分析表明，基因长度的变化主要是由内含子长度的变化引起的，且这种变化与物种进化的关系非常密切（图3）。

图5 MeP5CR对干旱和低温胁迫的响应

聚类分析表明，各物种中P5CR的亲缘关系与物种之间的进化关系呈现很好的一致性。而且，无论是在低等藻类藓类植物中，还是在高等单子叶和双子叶植物中，大多数物种有且仅有1个P5CR，与前人研究结果一致［10］。说明P5CR是单基因起源的，且在各物种之间非常保守。尽管如此，仍有少数物种中的P5CR发生了2-3次重复：这些重复或只发生在某一物种内部，如P5CR基因在大豆（GmP5CR1和GmP5CR2）中发生了一次重复，但在菜豆中没有发生重复；或发生在某两近缘物种分化之前，并在分化之后继续保留在两近缘物种中，如卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2；或以上2种情况同时发生，如巴旦木和苹果中的P5CR基因（图2）：产生这种结果的最大可能性是，在巴旦木和苹果分化之前，P5CR基因发生一次重复，使得巴旦木和苹果中分别保留有2个P5CR基因（PpeP5CR1和PpeP5CR2，和MdP5CR1和MdP5CR2）；在巴旦木和苹果分化之后，巴旦木中的P5CR基因维持不变，而苹果中的P5CR基因再次发生一次重复（如MdP5CR1发生重复获得MdP5CR3）。这一推测从基因组结构分析上也得到了验证：PpeP5CR1和PpeP5CR2、MdP5CR1和MdP5CR2在染色体上分别成串联重复排列，且相互之间具有共线性。值得强调的是，本研究并没有发现在某一植物不存在P5CR，这可能是因为P5CR丢失后会引起植株致死［8］。以上结果比较系统地阐述了P5CR在植物中的进化方式，为进一步研究其在不同物种中的功能奠定基础。

P5CR在不同植物中非常保守，暗示它们可能具有相同的功能，在基因表达水平上通常表现为相同的表达模式。拟南芥中AtP5CR在茎中的表达量最低，而在根中表达量最高［11］；木薯中MeP5CR也表现出相同的表达模式，支持“根是脯氨酸生物合成的主要场所，而茎则主要是负责脯氨酸的运输”的结论［11］。研究表明，P5CR的表达还受到干旱、低温、盐和ABA等处理的诱导。例如，在低温胁迫条件下，AtP5CR的表达量上升了约3倍［12］；在盐、PEG、低温和ABA处理条件下，LpP5CR的表达量被诱导了约2-4倍［14］。本研究发现，在低温胁迫条件下，MeP5CR的表达量在未展开叶、第一片完全展开叶、和根中分别上升了3.7倍、5.9倍和1.9倍；然而，在干旱条件下，MeP5CR的表达量却被显著的抑制了，暗示不同植物中P5CR对同一胁迫的响应可能是不一样的。本研究结果将有助于深入了解P5CR在不同植物中的进化模式，同时也为进一步研究MeP5CR在木薯干旱和低温等逆境胁迫中的功能奠定基础。

4 结论

在不同植物中，P5CR内含子长度差别较大，而在氨基酸长度、外显子数目、等电点和分子量方面差别不大。在大多数植物（如木薯）中，P5CR有且仅有1个拷贝，在进化上比较保守；而在某些植物（如大豆、苹果等）中有2-3个拷贝，并将其进化方式归纳为3种模式。木薯MeP5CR在叶片、须根和储藏根中表达量最高，而在叶柄和茎中的表达量最低。此外，MeP5CR表达量受到低温胁迫诱导、但被干旱胁迫抑制。

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