中华鳖性别决定中主导性因素的研究进展及思考

高丽丽 刁晓明 李云 翟旭亮 周春龙

（1. 西南大学动物科技学院 重庆三峡生态渔业产业技术研究院，重庆 400715；2. 西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715；3. 重庆市水产技术推广总站，重庆 400020）

脊椎动物性别决定是生物学研究的一个核心的领域。其性别决定机制的多样性非常值得关注，特别是爬行动物。脊椎动物的性别决定方式有两种类型，即基因决定型（Geneotypic sex determination，GSD）和环境决定型（Environmental sex determination，ESD）［1-4］。GSD 类型指子代的性别是通过受精决定，它不受外界环境的影响，胚胎发育成雌性或雄性取决于其性染色体的组成。XY型（或ZZ型）发育成雄性，XX型（或ZW）型将发育成雌性［4］。ESD类型指受精卵发育成雌性还是雄性依赖于环境对个体发育早期的影响（如温度、湿度等）［5-6］，在这种类型中，以温度依赖型性别决定（Temperature-dependent sex determination，TSD） 方式最为广泛。

爬行动物的性别决定机制研究领域丰富广泛。20世纪50年代以前，爬行动物是否有性染色体的分化，尚不清楚。直到1962年，Becak［7］第一次报道爬行类存在异型染色体后，后续的研究证实爬行动物存在GSD类型。爬行动物生命中的两个重要事件：一是繁殖机制（卵生还是胎生）；二是性别决定方式（GSD还是ESD中的TSD）。以前研究者认为TSD机制和卵生有关系，和胎生不可能有关系［8］。最近这种观点被推翻［9］。研究者发现雌性胎生蜥蜴在持续高温的实验条件下，后代全部是雄性。由于其在实验室进行，自然条件下能否有同样结果不得而知。这些研究结果表明爬行动物的胎生繁殖机制和性别决定方式的选择与哺乳动物并不一样，其机制有待深入研究。爬行动物中同一个目，同一个科甚至同一个属的物种之间也会存在不同的性别决定方式。不论是胎生还是卵生的物种都可能出现GSD或者TSD机制，或者二者同时出现。

孟德尔遗传分离定律解释了后代1∶1的性别比例，只要不同性别适合度没有差异，性别比例就趋于统一［10］。如哺乳动物GSD类型，但并不适用非哺乳动物，如蜥蜴类中的小染色体［11］，有鳞目中的多性别和同型染色体系统等［12］。所以尽管性染色体与GSD机制关系密切，但要阐明爬行动物GSD的具体机制，仍然是个难题。龟鳖类是爬行动物中十分特化的一个类群，最早出现在晚三叠纪，与恐龙同代，至今已有2.5亿多年的历史［13］，在漫长的地史演变历程和地质变迁方面具有重要参考价值［14］。

中华鳖隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科（Trionychidae）、鳖属（Trionyx），是一种名贵水产动物［15］。我国目前已成为世界最大的中华鳖养殖、消费和出口的国家。中华鳖养殖业是我国高效特种水产养殖业之一，近几年，由于生态环境的破坏和人为猎捕，野生鳖自然资源迅速衰退，而市场需求量不减，开展中华鳖保护状况研究已刻不容缓［16］。中华鳖生态养殖也是重庆打造百亿生态渔产业链的重要特色养殖品种。雄鳖各方面的性状优良，单价相对高，比雌鳖更受市场欢迎，然而目前距离实际应用还很遥远（子代雄性比例＜65%）［17］。为此，国内外学者开展了大量研究，并取得了丰富的研究成果［18-22］，但缺乏系统的报道。鉴于此，本文对爬行动物（中华鳖）性别决定方面的研究进行了综述，并探讨爬行动物性别主导因素之间的关系，以期为精准攻克中华鳖育种难题奠定理论基础，助推中华鳖生态产业健康持续发展。

1 中华鳖生物学特征

我国分布的鳖属动物有两个种，即中华鳖和山瑞鳖（Palea steindachneri）。中华鳖最常见，俗称甲鱼、王八、团鱼、神守等［9］。除西藏外分布于我国各个地域，国外分布于俄罗斯、日本、朝鲜、越南［23］。因地域气候和养殖生态环境的不同，在体色上略有差异。中华鳖用肺呼吸，是以肉食为主的杂食性动物，形态扁平，呈近圆形或椭圆形，背甲周边有一圈从外向内，由薄到厚的结缔组织（俗称“裙边”），裙边宽厚程度是判断中华鳖品质优劣的一个重要指标。我国是世界上养鳖最早的国家，早在春秋时代范蠡的《养鱼经》（公元前 460 年）中就有“内鳖则鱼不复去”的记载［24］。目前中华鳖已被列在《国家保护的有益或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》。近年来的环境恶化和过度捕捞，野生中华鳖又被自然保护联盟的红色名录中列为易危状态。

中国首位诺贝尔自然科学奖得主屠呦呦在卡罗琳医学院诺贝尔大厅作《青蒿素的发现中国传统医学对世界的礼物》的演讲中提到 “中国医药学是一个伟大宝库，应当努力发掘，加以提高”。中华鳖在中国传统医学具有重要影响力。屈原《楚辞-招魂》载“腼鳖炮羔，有拓浆此”，乃楚国宫廷之佳肴；根据《神农本草经》、《本草纲目》记载，鳖肉滋阴补肾、健脾健胃和清热消淤等功效，可以治疗阴虚阳亢、久病泄泻、妇女闭经、虚弱盗汗等症状。中华鳖的血富含动物胶、碘和维生素D，外敷可除中风口渴、还可以补血、消肿、平肝火，治疗肝脾肿大和肝硬化等症。此外，鳖制品具有抗癌和降低类固醇等作用［25］。但目前还没有全面挖掘其对人类的价值，研究成果大大滞后于它对社会的影响。

2 中华鳖性别决定机制的研究

2.1 中华鳖温度依赖型性别决定机制研究

爬行动物作为变温动物，和温度之间的关系一直是ESD机制研究的热点之一。自1966年首次报道TSD机制［26］。经过数十年的研究，研究者陆续发现爬行动物普遍存在TSD模式［27-29］。爬行动物TSD模式分为三种：MF型（低温产雄性，高温产雌性）；FM型（低温产雌性，高温产雄性）；FMF型（低温和高温均产雌性，中间温度产雄性）［30］。2012年发现一种新的FMFM模式［31］。关于爬行类TSD模式结论存在分歧。Bull［32］证实斑睑虎（Eublepharis macularius）的TSD机制属于FM模式，但Viets等［33］发现，在雄性孵化温度下，随着温度增加，雌性比例大幅度增加。这样斑睑虎的TSD模式就不再是FM型，而是FMF型。

属于TSD机制的物种通常缺乏性染色体，胚胎性别的分化取决于卵孵化温度［34］，且其影响具有时效性［35］。孵化温度只有在温度敏感期（Thermal sensitive period，TSP）对后代比例有显著影响［8］。在TSP期间，使用芳香化酶（雄激素转化为雌激素的关键因子）抑制剂或者雌二醇（Estadiol，E2）可以反转性别［36-38］。研究已报道孵化温度影响鱼类、龟鳖类、蜥蜴、鳄鱼等性别分化方向［8，10］。但是其作用机制比较模糊。最近报道高温反转性别时，物种体内基因伴随着大量的甲基化修饰，认为环境可能和甲基化修饰有关［39］，但是有待深入探究。

爬行动物TSD机制的生理和生态调控机理已有相关报道［40-41］。可是TSD机制是爬行动物正常生命史的一部分，还是只发生在人工或实验条件下，目前不清楚。有报道TSD机制适应寿命短的鱼类［42］和蜥蜴［43］，性别比例轻微偏离 1∶1［44-45］。然而还没有其适应长世代的龟鳖类的报道。因为1∶1的性别比例对长世代物种来说是最优选择，如果温度决定性别，那么为了维持最优性比，这些TSD物种是如何适应不断变化的气候和条件［46］，怀卵母体可以通过选择巢址或者预测后代性状来优化后代性比［47-49］。但是，根据自然选择论，这些个别选择并不能够保持稳定，TSD种类很可能面临生存威胁。

温度影响下的性别漂变现象能否使TSD较GSD机制在爬行动物的现实生物界中更具有优势［4］，研究者对此提出了许多假说和模型，并在个别物种中取得了标志性的结论，可是这些结论是否具有普遍性无从得知。可以认为当环境对一种性别更有利时，TSD比GSD机制有优势［50］。关于TSD和GSD机制的关系，有一些认为GSD机制是祖先类型，TSD机制是衍生方式［51］。有学者则认为TSD机制是原始方式，GSD机制是独立进化的分支［52］，还有学者认为TSD机制实际上是异常的GSD机制，两者之间可以发生转换关系（TSD-GSD，或者GSD-TSD），并主要发生在鱼类、壁虎、蜥蜴和龟类［53-54］。研究也表明TSD-GSD机制转变在长世代种类更易发生，因为寿命越短越增加由TSD机制带来的负面效应，如性别比例漂变［55］，然而目前GSD-TSD机制转变在脊椎动物中还很少发生［56］。因为容易产生YY或WW型致死个体。近年来借助基因组测序技术进行甲基化修饰、转录组等研究发现龟类TSD-GSD-TSD机制转换［54，57］，这种转换伴随着1-20倍高速率的染色体数目进化的细胞重组，并且得到研究者验证［58-59］。这些研究结果意味着TSD和GSD模式的转换途径具有多种多样的特点。

从目前研究结果来看，TSD机制在爬行动物中具有种类多样的特点。不同物种的TSD模式、同一物种中不同TSD模式的内在调控机制以及TSD机制和GSD机制的关系都需要进一步的研究和探索。中华鳖作为爬行动物代表，中华鳖TSD机制研究仍然停留在宏观层面，国内朱道玉［21］认为中华鳖属于TSD机制，低温产雌性，高温产雄性；而聂刘旺等认为低温产雄性、高温产雌性［20］；Kawagoshi等［18］报道中华鳖存在微小型ZW/ZZ型性染色体，认为中华鳖性别决定方式属于GSD机制。ESD类型理论上不存在异型性染色体。但是，国外学者发现温度确实可以改变中华鳖后代性比，由于比例数量差距不大，所以并不能说明中华鳖属于TSD类型。以上研究结果表明，由于实验条件不同，其结果目前还不能参考，而TSD机制还可能涉及激素、酶活性及pH水平等，所以这些难题的解决需要我们更深入的研究工作。

2.2 中华鳖基因型性别决定机制（GSD）研究

爬行动物GSD机制的复杂程度介于鱼类和哺乳类之间。有些只属于GSD机制［60］；有些属于GSD机制的后代性别比例也易受环境的影响［61］，例如豹子壁虎［62］和蜥蜴［63］。甚至自然条件下严格的GSD机制，在实验条件下温度也会发挥重要作用［64］。在这种情况下温度不是自适应的，而是温度的副作用在影响此分子过程［2］，如温度通过影响酶的活性（芳香化酶）和性别决定基因的表达来操控该过程。此外，在紧密相关的类群中也会发现不同的性别决定机制［65］，甚至在同一物种不同的种群中［66］，性别决定机制的转换也是高频率的发生在同一个进化时间尺度上［67］。目前很多研究证实在亲缘关系较近的爬行动物中同时具有GSD和TSD机制［63，68-70］，这说明TSD和GSD机制的界限是模糊的［71］。为了解释TSD和GSD机制的相互作用，研究者假设：GSD+EE型，即理论上基因决定性别，但是在胚胎发育的过程中性别可以被温度反转；TSD型，即对环境敏感且可以发生遗传的变化，可是在个体水平上性别是由环境决定的，所以仍然被归为TSD型；TSD+GSD型，即性别由温度或基因决定［4］。根据这些研究结果，我们推测两种机制的进化过程可能是相似的，只是为了适应不同的环境，某一种机制会选择加速进化。

性染色体在GSD机制中扮演重要角色，性染色上的基因决定物种性别［72］。目前在属于GSD类型的20种龟类中已发现8种存在不同的性染色［11，73］。哺乳动物属于典型的GSD类型，其雄性性别由SRY基因启动［74］。只要其在胚胎期选择好性别，个体的性别在整个生命中会保持稳定。非哺乳动物普遍缺失SRY基因，研究报道除Sry外，哺乳动物中Sox9、Cyp19a1、Dmrt1、Dax1、SF-1、Mis、Foxl2和Amh等基因参与了爬行动物胚胎性别决定［57，75］。生殖嵴和后来双向潜能性性腺发育涉及Sf1［76］和Wt1［75］基因。雄性性别决定和分化通路涉及Sox9［58，77］和Dmrt1［51］等基因。雌性性别决定基因的研究没有雄性那样清楚和快速。Foxl2［51］、Cyp19a1［51］和Rspo1［57］基因同时参与属于GSD和TSD机制的脊椎动物的卵巢发育。这些物种的大脑中存在起始温度敏感位点，温度通过性腺本身调控温度敏感基因的变化，最后通过神经传导改变性别［78］。性别决定依赖这些关键基因，如果某一种被干扰，性别则可能被反转。非哺乳动物个体的性别时常发生变动，例如在鱼类和爬行动物中性别表型决定即使在成年阶段也不是最终的。特别是物种变化的生活环境会加速其性腺和性别表型的改变。因此对于爬行动物而言，个体的遗传表型和其所携带的性染色体没有必然的关系［76］。

以上研究结果表明，GSD机制物种中性别相关基因会响应温度的变化。哺乳动物和爬行动物性别基因具有保守性，但是爬行动物中的性别基因会被外界影响，不像哺乳动物体内具有恒温机制，可以避免温度对体内基因的影响。按照脊椎动物进化路线分析，TSD机制是低等脊椎动物中随着进化需要不断完善的性别决定机制，GSD机制是进化到高等阶段采用的性别决定方式，同时存在的GSD和TSD机制是中间方式，无论TSD-GSD，还是GSD-TSD转换也只发生在进化不完善的物种中，爬行动物中出现多种GSD类型可能是由于其物种丰富，生活环境不同，进化历程不统一等造成的。即使在哺乳动物中，敲除关键基因，性腺表型也会发生在成年个体或胚胎的性腺发育过程中［79］。所以，即使在成年个体，脊椎动物的性腺结构和功能也需要很多因素来积极维持。综上，基因在脊椎动物性别决定中占有重要作用。

爬行动物中参与GSD机制的相关基因与哺乳动物中Sry基因相比，作用是微弱的，可以被温度轻易反转。在基准温度下，胚胎形态分化的第一个阶段比在雌性或雄性孵化温度下推迟，说明没有温度的作用，基因诱导性别过程时间会延长，要发育为雌性或雄性，必须达到一定阈值。对于TSD机制，并不是基因对性别没有作用，没有基因影响，性别比例不可能形成，所以温度和基因关系很密切，共同决定性别。对于爬行动物，环境因素的影响要大于基因效应。

爬行动物普遍缺少性染色体，但是已经证实在中华鳖中存在微小型ZW/ZZ型染色体，所以中华鳖性别决定方式应属于GSD机制。虽然目前对中华鳖性别调控机制有了一定程度的认识，但这种认识并不完整。动物性别决定发生在一个时间段并依赖几个关键基因［76］。从现有研究来看，关于中华鳖GSD机制的研究比较空白，大部分集中在时空表达水平分析，主要有Cyp19a1［80］、Amh［81］、Sox9［82］、Dmrt1［82］和Foxl2［22］。这些关键基因在中华鳖组织中呈性别二态性表达，功能和其它脊椎动物中的功能有细微差异，进一步表明脊椎动物性别决定基因功能的保守性

3 结语

爬行动物的进化比较特殊，性染色体的进化处于过渡状态，仍然保留低等动物性染色体的特征。爬行动物的性别决定受温度和基因双重调节，在极端温度下，温度甚至可以超越基因效应。其性别分化前后，相关基因的上调或下调是爬行动物性腺发育的原因还是结果，尚不清楚。外源性激素诱导部分胚胎及成年脊椎动物性腺分化的观点已被普遍认同［83］，但性激素是影响正常性腺分化中某一成分的功能还是干扰正常生化反应的模式也不清楚。为什么在爬行动物中性别决定基因会感应温度的变化；如果是因为其缺乏恒温机制，那么在鸟类这样恒温动物中，为什么外源因素诱导性别改变的现象一样存在。此外，在爬行动物中，GSD和TSD机制之间的转换是连续的还是中断的，具体过程是怎样的？这些问题依然是谜。总之，爬行动物性别决定通路相关基因的功能、温度主导因素的作用机理及性别决定机制的进化途径仍存在许多未被研究清楚的问题。

从现有研究来看，一方面，如果爬行动物不能快速适应以避免性别漂变的负面影响，再加上内部遗传因素的冲突影响，全球气候变化将对其造成严重威胁［84］。理论上，它们可以通过机制转换、改变热敏性，或者调节自身生理和行为等方式的来削减负面影响。但生理或性别决定机制似乎不太可能，因为这些机制是经历了长期的进化选择后所保留的，具有较高的稳定性和保守性［85］。而母体效应进化的速率也与气候变化的速率不一定一致，即使它们可以通过自身机制削弱环境温度对后代性别影响［37］。但是如果外界温度超过胚胎孵化温度的阈值，这些物种则无法调控温度带来的负面效应。另一方面，存在于水生环境中的许多化学物质具有雌性化效果，因为它们能够通过模仿雌激素与雌激素受体结合的作用来破坏内分泌系统。综上，TSD种类的生存形势不容乐观。而GSD种类因为有遗传系统的保护，可以有幸避免。

本文对爬行动物性别决定中主导因素的最新研究进行阐述，不是去预测未来会发生什么，只想了解性别决定基因、激素和温度的作用，为什么在自然界中会存在如此差异的性别决定机制，这些主导因素在此过程中是如何作用的？从而为其他脊椎动物性别决定的研究提供资料。爬行动物性别决定及性别分化具有很大的不稳定性和可塑性，利用外源激素来培育单性苗种可能产生一定的安全隐患，而温度确实可以影响以上过程的发生，所以通过控制温度来培育经济价值高的单性苗种，是一种简便环保且实际可行的人工诱导性别分化方式。中华鳖作为爬行动物代表，其性别机制典型，国内研究较少，且野生中华鳖数量逐年递减。所以，期望加强其性别决定和分化机制的研究，也呼吁大家保护野生资源。

目前，虽然对爬行动物性别决定和分化的具体作用机制还不十分清楚，但是随着分子生物学、细胞学、遗传学的不断发展及测序技术和平台的不断完善，可以大大降低物种基因组测序的成本。这将在一定程度上助力爬行动物全基因组的挖掘，帮助研究者更深入地从分子水平阐释爬行动物性别决定和分化机制，同时我们就可以不用依赖模式生物的研究去探讨非模式生物的性别决定通路。所以，随着分子生物技术的不断发展以及研究范围的不断扩大和深入，越来越多的性别标志基因将会被发现，性别决定分子网络也会越来越完善，爬行动物性别决定和分化机制的揭秘值得期待。