卵泡抑素生理功能研究进展

李浩宇 贺晓云

（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2. 农业部转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京 100083）

卵泡抑素（Follistatin，FST）发现于1987年，由两位科学家Naoto Ueno和D.M.Robertson几乎同时分别从猪和牛的卵泡液当中提取出来，目的是为了找到一种抑制卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）的蛋白质［1-2］。尽管FST最初是作为一种脑垂体FSH的内分泌调节剂而从性腺中分离出来的，但随后在成年哺乳动物和胚胎的各种组织中都证实FSTmRNA和FST蛋白的存在，如心脏、脑、卵巢、睾丸、垂体、肾、肾上腺、骨髓、胸腺、骨骼肌和皮肤等。因此，目前一般认为FST大多是通过自分泌和旁分泌的方式在组织与器官中产生［3-4］。FST是一种富含半胱氨基酸的分泌型糖蛋白，由于FST对FSH、激活素（Activin，ACT）和TGF-β超家族成员具有很强的亲和性，故对这几种蛋白有高水平的调控作用，它可以通过几乎不可逆的方式与激活素绑定，从而使其无法与自己的受体结合［5-6］。FST在结构上具有高度的保守性，在哺乳动物中FST的同源性达到了95%。

成熟的FST蛋白有3种亚型，分别为FST-288、FST-300和FST-315。FST基因序列中包含了6个外显子，在RNA水平可以被剪切为编码344与317个氨基酸的mRNA片段，其中FST-315与FST-288两种形式的蛋白便是这两个mRNA在经过剪切N端编码27个氨基酸片段的基因之后由外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ与外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ所编码的蛋白，而FST-300则是FST-315在体内进一步水解产生的［7］。FST的3种亚型在不同的组织中分布，且与细胞表面的结合能力各不相同，这暗示3种FST亚型蛋白在具有各自独有的生理功能［8］。根据Sidis等［9］的研究显示，这3种亚型FST蛋白与激活素的亲和能力不相上下，而与细胞表面的结合能力FST-288 ＞FST-303 ＞ FST-315［10］。在体外实验中，当激活素和FST-288会被抑制，而FST-315的表达量升高，与激活素相关的TT细胞也出现了增殖的情况。

FST的3种亚型的存在、多组织表达的特性暗示着FST在机体中具有多种功能。除了可以调控FSH的分泌［11］，FST还具有促进卵泡成熟［12］与精子发生［13］，促进骨骼肌发育与分化，促进脂肪棕色化，促进棕色脂肪分化，调节肝内稳态［14］，促进伤口恢复［15］，炎症反应的抑制［16］等多种功能。但目前关于FST的医学应用还尚未开发成熟，本文是整理近年来国内外FST生理功能的研究动态与相关机制的发现，并以FST药用的角度作出展望，旨在为日后FST的医用开发奠定理论基础。

1 FST的生物学作用

1.1 FST对卵母细胞成熟与胚胎早期发育的作用

1.1.1 FST促进卵母细胞成熟与胚胎早期发育作用的发现 FST作为从卵泡液中提取出来的蛋白，是卵巢卵泡内重要的局部调节因子，对卵母细胞及胚胎的成熟发育具有重要的促进作用［17-18］。Jorgez等［12］的研究表明，敲除成年动物颗粒细胞的FST基因后其卵泡和卵母细胞成熟迟缓，卵巢活动提前终止最终导致生育能力显著下降。有研究表明在受精7 d后处于卵裂期的牛胚胎中添加外源FST，可以显著提高早期卵裂率，囊胚率和扩张囊胚率以及滋养层细胞数量促进胚胎发育［19］。王春强等［20］探究了关于FST对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响，结果表明FST对牛卵母细胞的体外成熟无显著影响，但是10 ng/mL的FST可以显著降低囊胚率，5、10和20 ng/mL的FST均可显著提高受精卵的总卵裂率，表明FST对胚胎发育有促进作用。刘星等［21］研究了FST对，结果显示猪卵母细胞和早期胚胎中FST的mRNA表达量上调；外源FST的添加会提前初次卵裂时间提高囊胚形成率，暗示着FST在调控卵母细胞成熟和促进胚胎发育过程中有重大作用。

1.1.2 FST促进卵母细胞成熟与胚胎早期发育作用机理 有研究表明，FST调节卵母细胞成熟主要是在卵泡中通过激活素（ACT）-抑制素（INHA）-卵泡抑素通路实现的，卵母细胞上存在着激活素受体并且在成熟的卵母细胞中，FST表达水平显著高于未成熟的卵母细胞［22-23］，这都提示着FST对卵母细胞的成熟有重要的调控作用。陈颖，何方方等［24］通过在生发泡期的卵母细胞中加入不同组合与浓度的激活素A（ACTA）、抑制素A（INHA）、FST，探究了激活素-抑制素-卵泡抑素系统影响小鼠卵母细胞成熟的机制，结果表明ACTA，INHA对生发泡期的卵母细胞体外成熟有明显的促进作用，且这种促进作用会被外源添加的FST所抑制，但是当卵母细胞中ACTA，INHA不足时，FST会对卵母细胞的成熟起促进作用［24］。有研究表明骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMP）可以调节FSH、雌激素与孕酮之间的平衡，影响小鼠胚胎细胞滋养层的发育，而FST可以与BMP特异性结合或者与BMPs通路上重要的信号蛋白Smad结合，从胞内与胞外两方面来调节BMPs信号通路，进而影响卵母细胞的成熟与胚胎发育［25-26］。

1.1.3 FST促进卵母细胞成熟与胚胎早期发育作用的生物学意义 胚胎工程对于当代医学和生物技术学有重要意义，而卵母细胞的成熟与胚胎的发育又是胚胎工程中重要的一环，它作为辅助生育的前沿技术，在多囊卵巢综合征、卵巢反应不良、妇女生育力保存等方面应用前景广阔，并且对于体外受精技术和动物克隆技术，卵母细胞的体外成熟和胚胎的早期发育也显得至关重要［24，27］。FST作为一种可以调控卵母细胞成熟与胚胎发育的细胞因子，对胚胎工程这一生物学技术的发展具有重要推动作用［28］。有研究表明，FST在人类的胚胎阶段适当表达可以促进胚胎早期卵裂，进而促进了胚胎在囊胚期的发育及后期胚胎的着床［29］。适当的FST表达会促进胚胎发育，但是过量的FST表达可能会造成胎儿生长受限，于芳芳等［30］对30个患有胎儿生长受限的新生儿的胎盘进行了关于FST表达的免疫组化及实时荧光定量PCR分析，结果表明生长受限胎儿的胎盘中FST表达量显著高于正常胎儿。由此来看想要使FST真正应用于辅助人类生殖上还需要更多的临床试验的推动。

1.2 FST对骨骼肌增殖分化的调控作用

1.2.1 FST对骨骼肌增殖分化的调控作用的发现 虽然FST是在卵泡液中发现的，暗示着它参与了动物的生殖能力的调控，但许多动物实验都表明当外源注射FST时，实验动物身上都出现了骨骼肌过度增长的表型［31］。李西和聂芬等［32］通过构建FST转基因斑马鱼探究高表达FST对肌肉生长的影响，结果显示在高表达FST的转基因鱼的骨骼肌中，肌纤维数目明显增加，单位面积中肌纤维数量增加，表明FST确实促进了斑马鱼肌肉的生长。与斑马鱼的动物实验结果类似，FST的转基因小鼠也出现了相同的结果［33］。在定向突变纯合子小鼠的骨骼肌中过表达FST基因会导致新生小鼠的肌肉质量明显下降［34］。体外实验表明，FST表达量的提升可以促进肌肉细胞的分化和肌肉的再生［35］。此外，PGC1-α，P21表达量提升时也与FST具有相似的结果［36］。

1.2.2 FST对骨骼肌增殖分化的调控的作用机理 FST促进骨骼肌增殖分化的机理与TGF-β超家族蛋白息息相关。MST是TGF-β超家族的一员，一直被认为是一种骨骼肌的负向调节剂［37］。敲除了MST基因的纯合子小鼠的骨骼肌质量出现了快速且显著的增长，由于肌纤维开始肥大和增多，导致MST敲除鼠的肌肉重量约是野生型小鼠的两倍［38］。此外，关于牛、羊、狗和人的遗传学研究都表明了MST作为一种肌肉增长的负面调节剂跨越了多个物种［39］。MST的功能通过一些能够与它相结合的蛋白来调控，而FST就是其中之一。通过体外基因分析实验，FST可以与MST结合从而阻碍MST与其他受体相连接［40］。FST不仅可以与MST结合从而抑制MST活性，而且可以与MST调节肌肉发育的信号通路下游Smad蛋白竞争性结合，阻碍信号通路，从而减弱MST对骨骼肌增长的抑制作用［41］。而FST对骨骼肌增长的促进作用不仅是由于它对肌肉抑制剂MST具有抑制作用，有实验表明FST对肌肉的增殖效果要强于只抑制MST对于肌肉的增殖效果［42］。Act A是一种近年来发现的被认为与MST具有类似的抑制肌肉生长功能的TGF-β超家族蛋白，研究发现FST会调控Act A进而促进肌肉的生长。有实验表明，在小鼠中表达只能与MST相结合而不与Act A结合的FST，肌肉的增加量与过表达正常FST蛋白的小鼠相比下降了18%，也说明了FST会通过调控Act A来促进肌肉的增长［23，43-44］。在抑制MST的基础上使用Act A抗体特异性抑制Act A活性会大幅促进肌肉的增长［45］，这都说明了FST可以通过抑制Act A来调控骨骼肌的发育［46］。此外，FST也能通过调控骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）［47］间接调控骨骼肌发育。BMPs可以通过Pax-3表达通路促进骨骼肌前体细胞增殖进而促使骨骼肌增长，也可以诱导细胞凋亡来抑制骨骼肌增长［48］。Amthor等［49］的研究表明，在鸡的腿部过表达FST会提升 BMP7促进骨骼肌增长的功能并且抑制BMP7诱导细胞凋亡。综上，FST可以通过影响多种信号通路进而促进骨骼肌的生长。

1.2.3 FST对骨骼肌增殖分化的调控作用的医学应用 杜氏肌肉营养不良症是一种伴X染色体隐性疾病，它是由于肌纤维中抗肌萎缩蛋白缺失所造成的，患病者的肌肉更容易受到损伤，肌肉退化甚至被脂肪和结缔组织替换［50］。抑制MST蛋白会使得骨骼肌迅速增长，增加肌肉力量，这为治疗肌肉萎缩提供了思路。已有实验证明，通过多种途径抑制MST，如使用抗体，过表达MST抑制蛋白前体，阻断下游ActRⅡB信号通路［51］，会使肌肉萎缩小鼠模型的肌肉在质量与力量上均得到增长［52］。虽然抑制MST可以促进小鼠肌肉的增殖分化，但在包括人类在内的灵长类动物中，单独抑制MST所起到的肌肉增殖作用并不明显［53］。FST与ActRⅡB结合可以阻碍多种通过ActRⅡB传导抑肌信号的骨骼肌负调控因子（MST，BMP9，BMP10）及多种刺激素（Activin A、B、C和E）使得其具有显著的促进骨骼肌生长的作用［54］。但是由于FST的调节范围太广，有些ActRⅡB的配体蛋白可能具有其他重要的功能，会出现一些不能预期的副作用。有关肌肉萎缩症的临床治疗实验也因为出现了溶血的并发症而不得不停止［55］，后续研究指出这是由于ActRⅡB的配体之一BMP9受到了抑制导致的，这种蛋白在调节骨骼肌发育的同时还与内皮细胞的功能有关［56-57］。根据现在的研究基础来看，FST用于治疗人类的肌肉萎缩症等肌肉相关疾病还需要进一步研究。

1.3 FST促进脂肪棕色化作用

1.3.1 棕色脂肪与其生物学意义 棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT）是人体非颤栗产热的主要来源，对于新生哺乳动物的产热具有重要作用［58］。棕色脂肪与主要以甘油三酯来储存能量的白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）不同，棕色脂肪具有很强的能量消耗能力，它可以通过促进甘油三酯与葡萄糖的消耗来促进机体生热［59］。棕色脂肪有两个最大的特点，其一是棕色脂肪是以多腔脂质滴的形式聚集脂肪，而另一个特点是棕色脂肪内部存在关键的产热蛋白，解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）它只存在于哺乳动物棕色脂肪中，在棕色脂肪线粒体中大量表达。UCP1存在于线粒体内膜上，它可以在线粒体内膜生成可以使H+内流的跨膜“质子漏”，使线粒体呼吸作用与氧化磷酸化解偶联，使得经过三羧酸循环并沿电子传递链释放的能量直接以热能形式释放而不是用于合成ATP［60］。当机体处于特定的环境中如冷暴露时，白色脂肪会向棕色脂肪转化，生成米色脂肪（Beige adipose tissue）。米色脂肪在结构上与棕色脂肪相似，均为多腔脂质滴，并且也会表达UCP1等棕色脂肪特征蛋白，加强脂肪消耗，增加机体产热［61］。近年来有许多研究表明FST可以促进棕色脂肪的分化和白色脂肪棕色化，这对通过棕色脂肪增加机体能量代谢，降低胰岛素抵抗，预防肥胖及糖尿病具有重大意义［62］。

1.3.2 FST促进脂肪棕色化作用的发现 Braga等［63］成功构建了MST敲除小鼠，并与正常野生型小鼠对比后发现白色脂肪中棕色脂肪特征蛋白开始表达，暗示着棕色化的开始。相似的结果在Shan等［64］的研究中也有出现，他们发现在MST敲除鼠的白色脂肪中，产热基因UCP1，PGC1α的表达量显著上升，米色化相关基因Tmem26和CD137转录水平也得到了提升。Choi等在MST敲除型小鼠中也发现了相比于正常野生型小鼠，MST敲除鼠的脂肪酸氧化程度和能量代谢水平更高［65］。FST作为MST的抑制剂，在棕色脂肪分化的过程中表达量显著上升，并且在冷刺激条件下，小鼠的棕色脂肪中FST表达量也得到了显著提升。敲除了FST基因的小鼠在刚出生不久就死亡，解剖后发现棕色脂肪含量过少，肌肉发育不完整，导致新生小鼠无法正常产热维持体温［34］。在分化中的前脂肪细胞中添加外源FST，产热基因的表达量增加50%-80%，棕色脂肪特征蛋白显著增加，而FST基因敲除的胚胎细胞中UCP1蛋白的表达量相比于野生型细胞下降了50%，这些结果都说明了FST影响了棕色脂肪的形成与分化［66］。

1.3.3 FST促进脂肪棕色化的作用机理 Singh等［67］进行了FST转基因小鼠的动物实验，当 FST过表达时，棕色脂肪质量增加，白色脂肪中棕色脂肪与米色脂肪特征蛋白表达量均有所提高，表明棕色化已经形成，并且磷酸化的pp38MAPK/pERK1/2通路上的蛋白表达水平也得到提升。在3T3-L1脂肪前体细胞中，用药物抑制pp38MAPK/pERK1/2通路的同时添加外源FST，结果显示由FST诱导的UCP1蛋白的表达受到了阻碍，这暗示着FST可能是通过pp38MAPK/pERK1/2通路来诱导脂肪棕色化的。在MST敲除鼠中出现了白色脂肪棕色化，经Shan等［64］的研究发现，这是通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-过氧化物酶增殖物激活受体（PGC1α）-鸢尾素（Fndc5）通路导致的。MST的缺失会导致AMPK蛋白表达量增高，而AMPK间接激活了PGC1α和Fndc5的表达，Fndc5作为一种肌肉因子会促进棕色脂肪与米色脂肪相关蛋白的表达［68］。FST是MST的抑制剂，并且有研究证明外源FST会促进小鼠细胞Fndc5的表达［64］，这都暗示了FST可能是通过AMPK-PGC1α-Fndc5通路促进了白色脂肪的棕色化［69］。

1.3.4 FST促进脂肪棕色化作用的医学应用展望 在C57BL6J小鼠中检测各个组织FST的表达状况可以发现，在棕色脂肪和骨骼肌中，FST表达量远高于其他组织，而腹股沟中的白色脂肪和肝脏中表达量较高，在其余组织的表达量均在较低水平。棕色脂肪、肝脏、骨骼肌作为机体中重要的脂质、糖类代谢组织，与机体产热息息相关，这也暗示了FST对机体脂质糖类代谢与产热能力起到了调控作用［62］。Stanford等［70］通过对小鼠进行棕色脂肪移植来探究棕色脂肪是否可以调节体内血糖稳态发现，移植棕色脂肪过后，与同为高脂诱导的未移植肥胖鼠相比小鼠体内胰岛素敏感性提升，血糖随着移植时间的推移明显下降，说明棕色脂肪具有改善血糖稳态的重要作用。对高脂诱导的肥胖小鼠进行冷刺激或者肾上腺素受体激动剂处理来激活其体内的棕色脂肪，结果显示在高脂喂养的情况下，小鼠的体重并没有增长，并且注射肾上腺素受体激动剂的小鼠体重相比于对照组显著下降［71］。在关于棕色脂肪的人体实验中，260个健康志愿者接受了2 h的冷刺激，随后进行相关棕色脂肪的检测，在260人中只有125人（48%）检出了棕色脂肪，他们相比于未检出人群更加年轻，体脂率更低，胆固醇，低密度脂蛋白及血糖也较未检出人群低，暗示着棕色脂肪可以抵抗肥胖［72］。同样是人体实验，12名健康男性志愿者通过口服肾上腺素受体激动剂来激活体内棕色脂肪，通过PET-CT测量发现受试者的棕色脂肪代谢能力均得到提升，并且他们的静息代谢率（Resting metabolic rate，RMR）也显著升高［73］。动物实验及人体实验都说明棕色脂肪确实促进了体内的脂质、葡萄糖及能量代谢，具有一定的减肥降糖效果［74-75］。由此看来，FST作为一种分泌型蛋白，通过促进人体内脂肪棕色化，可以达到降低脂肪重量，治疗、预防二型糖尿病的效果，具有潜在的药用价值，但具体的应用开发还需要大量动物实验、临床实验进行安全性的评价。

2 结语

FST作为一种分泌型蛋白，在卵母细胞成熟与胚胎发育，肌肉的增殖与分化，脂肪细胞棕色化这三个方面具有明显的促进作用。FST的促进卵母细胞成熟与胚胎发育的作用可以极大提高胚胎工程的发展，更好辅助人类生育繁衍；促进肌肉的增殖作用可以应用于肌肉萎缩症的治疗；诱导脂肪细胞棕色化则可以改善体内能量代谢，血糖稳态，减少脂肪重量。当今人类不良的生活饮食习惯使得肥胖和二型糖尿病患者越来越多，已经严重威胁到人类的生命安全，FST棕色化作用的发现给人们治疗肥胖与二型糖尿病提供了更广阔的思路。

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