核磁共振技术在植物研究中的应用进展

韦 丹，李 涛，邹显花，陈思同，蔡一冰，马祥庆

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002； 2.国家林业局杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002)

核磁共振现象最早于20世纪40年代美国斯坦福大学的F.Bloch教授和哈佛大学的EM.Purcell教授等人用不同的方法观察到[1]。核磁共振的基本原理是将物体置于特殊的磁场中，用无线电脉冲激发物体内某一原子核(如13C、1H、17O、14N、31P)，使原子核发生能级分裂，当物质吸收到外来电磁辐射时，一些具有磁性的原子核在外磁场的作用下吸收一定波长的无线电波而发生共振吸收，从低能态跃迁至高能态，产生核磁共振现象，其吸收峰频率对吸收峰强度作图即为核磁共振波谱图[2]。

自核磁共振现象发现以来，核磁共振已成为测定物质结构的强有力工具，不但能够实现被检测植物样品内部结构和代谢产物的可视化，还可以分析被测活体植物体内的重要生理过程，因此这一技术被广泛应用于植物生理和发育、生物多样性、基因功能以及代谢作用等的众多研究领域[3]。但近年来，关于核磁共振技术相关的综述性报道多限于土壤和水体，对在植物研究中的报道尚不多见。鉴于此，本文将从核磁共振磷谱、氢谱、碳谱3个方面分别论述其在植物研究中的应用，旨在为相关学者了解核磁共振技术在植物科学中的应用提供科学素材。

1 核磁共振磷谱(31P-NMR)

核磁共振磷谱是磷原子的化学位移和与它相邻的氢原子裂分时偶合常数值随着化学环境的变化而不同，且在31P-NMR图谱中只对磷原子有信号响应，产生的信号强度与31P的数量成正相关，因此可对样品定性定量分析，能准确迅速地检测含磷化合物。31P-NMR不受其他元素干扰，分辨率高，可以广泛应用于测定植物、土壤等复杂样品中存在的多种形态的磷[4]。

1.1 31P-NMR在植物体内磷分级研究中的应用

31P-NMR前处理较简单，能够检测出样品中所有含磷化合物，并且根据振动频率不同分析各磷化合物形态。通过31P-NMR分析，正磷酸盐、磷酸单酯、磷酸二酯(磷酯和DNA)、焦磷酸盐和多磷酸盐等已被成功检测[5]。大量研究表明，植物中的磷主要以正磷酸盐和磷酸单酯2种形态存在，例如球茎草与三叶草中正磷酸盐占40%～60%[6]，小麦根系残体降解过程中释放的正磷酸盐占90%[7]。植物体内正磷酸盐的大量存在是因为其吸收的磷多以正磷酸盐的形式存在于植物液泡中。冯伟莹等[8]在31P-NMR图谱中发现湖泊水生植物和藻类中的有机磷(Po)主要以磷酸单酯为主，其平均含量分别占92%和83%。Ebuele等[9]通过31P-NMR研究罂粟、茴香、芥菜和芝麻籽种子特征，发现茴香种子正磷盐浓度最高，为41.7%，其次是芥菜和芝麻籽，分别为9.3%和6.9%，在茴香和罂粟种子中检测到少量的焦磷酸盐，正磷酸二酯唯一存在于芝麻籽中，而磷酸盐和多磷酸盐均没有检测到。管宏友等[10]以油菜、蚕豆为研究对象，利用31P-NMR深入了解植物残体中磷的分级情况，发现NaOH-EDTA萃取浓缩液中绝大部分是正磷酸盐和磷酸单酯，分别占全磷比例的67%、28%；并且植物正磷酸盐和磷酸单酯含量与全磷含量成正比。因此，31P-NMR技术能较好地研究植株体内的磷分级情况并且是反映植株体内供磷潜力的一种有力工具。

1.2 31P-NMR在植物细胞pH值研究中的应用

植物细胞内pH是体现细胞代谢变化的一个重要参数，与植物中一些酶的活性紧密联系[11]。在细胞内磷库施加强磁场后，其胞内pH值与31P-NMR图谱中的某些磷酸化合物共振峰的化学位移存在一定关系。31P-NMR测定pH可避免各种破坏所导致的细胞内部生理和代谢变化以及由此产生的测定结果的不准确性。Espen等[12]采用31P-NMR研究玉米根中NO3-的吸收对细胞pH的影响，发现随着NO3-浓度的增加，玉米根系中细胞pH降低，但在NO3-释放过程中，根系细胞pH值的变化可由调控其细胞质膜H+-ATPase活性来实现。Stefanovic等[13]使用31P-NMR技术发现悬浮铃木和拟南芥悬浮培养细胞在碳源存在的条件下，胞质和液泡中的pH值分别为7.40和5.20。刘于[14]通过31P-NMR研究磷饥饿胁迫条件下水稻根系细胞内的pH变化，发现水稻根系组织中液泡总磷酸盐峰最高；在长时间缺磷到恢复供磷过程内，水稻根系组织细胞液泡及细胞质内pH值的变化为先明显下降后又恢复至原来的水平。以上研究利用31P-NMR技术测定植物细胞内pH，不需要培养大量愈伤组织来获得植物细胞，这为日后研究植物细胞内pH值的差异及不同胁迫条件下的pH变化提供便捷有效的途径。

1.3 31P-NMR在木素结构研究中的应用

木素(Lignin)是植物纤维的三大组分之一，其含量仅次于纤维素，约占植物纤维的三分之一。木素对植物生长具有重要作用，能够与植物纤维中的碳水化合物生成木素-碳水化合物复合体。31P-NMR不仅弥补传统木素研究方法对木素结构有破坏性且费时多等缺点，而且可以清晰地分辨出木素中的脂肪羟基、羧基和酚羟基等特征官能团[15]，这对于定量测定木素中的重要基团非常有利。刘玉等[16]根据31P-NMR谱图得出三倍体毛白杨的原料木素中脂肪族羟基含量非常高，总酚羟基含量次之，羧基含量最低。董立斌[17]运用31P-NMR研究发现麦草烧碱蒽醌木素、玉米秸秆碱木素以及杨木、麦草混合硫酸盐木素3种木素中脂肪族羟基含量均最高，羧基含量最低，玉米秸秆碱木素中的总酚羟基的含量和羧基含量均高于杨木、麦草混合硫酸盐木素和麦草烧碱蒽醌木素。总酚羟基主要由缩合型和非缩合型的愈创木基型、紫丁香基型和对羟苯基3种结构单元组成。王少光等[18]根据31P-NMR谱图发现玉米全秆EAL木素主要由愈创木基型和对羟苯基2种结构单元组成，玉米秸秆皮质部木素则主要由对羟苯基组成。沈锋等[19]利用31P-NMR定量分析木素各酚羟基功能基团，分析发现巨菌草EMAL中脂肪族羟基含量最高，酚羟基中非缩合型酚羟基含量较高，缩合型酚羟基含量次之，羧基含量最低。因此，运用31P-NMR可以分析不同木素的结构并确定功能基团的结构和差异，为以后木素结构的研究提供便利。

2 核磁共振氢谱(1H-NMR)

核磁共振氢谱(1H-NMR)是根据核磁共振仪记录氢原子在共振下化学位移的变化而绘制的图谱[20]，它可以获取各种有机化合物和无机化合物的结构信息，是用于鉴定物质结构的重要方法之一。1H-NMR图谱中相应信号的强弱反映了混合组分中特征化学成分的相对含量，具有单一性、全面性、定量性和易辨性等特点[21]，对于植物的定性定量研究具有极其深远的意义。

2.1 1H-NMR在植物结构鉴定中的应用

1H-NMR图谱中特征峰的数目反映了样品中氢原子化学环境的种类；不同特征峰的高度比及强度比反映了不同化学环境氢原子的数目比。1H-NMR鉴定植物结构有其独特的特点，它可以同时获得各类质子化学的位移、数量、耦合关系等多个结构信息。例如，吴美玉等[22]使用1H-NMR法对19种前胡(PeucedanumL.)的乙醚提取物进行了快速的测试和解析，以鉴别真伪品，根据所含特征化学成分香豆素母核的化学位移，鉴定出19种前胡中只有白花前胡(P.praeruptorumDunn.)和紫花前胡[P.decursivm(Miq.) Maxim]为药品所示的正品前胡。秦海林等[23]采用核磁共振波谱仪测定了正品黄连样品及黄连伪品的乙醇提取物的1H-NMR图谱，发现黄连伪品没有出现天麻的特征共振峰，但所有的正品黄连均出现这一信号。用1H-NMR法鉴别中药植物的真伪，具有快速、准确、重现性好、信息多等特点。

随着检测技术的不断发展，二维和三维核磁共振技术也得到了广泛应用。需要注意的是，在进行1H-NMR图谱研究时，首先需要选择适当的提取分离工艺，制备其特征总提取物；对其进一步分离，得到单体化合物后，通过鉴定和1H-NMR研究，对图谱中的各个特征谱线进行归属，从而实现植物的结构鉴定。高效液相-核磁共振仪(HPLC-NMR)联用技术是由液相色谱提供分离技术，核磁共振仪提供结构解析技术，从复杂的样品中获得单一组分的图谱进行结构推测，解决了对于结构复杂样品的鉴定困难问题。例如，邹振兴等[24]采用液相色谱—核磁共振联用技术(HPLC-NMR)研究江南卷柏中的双黄酮类成分，先利用色谱法对其进行系统的分离纯化，再利用理化性质及多维核磁共振图谱等手段对分离得到的单体化合物进行结构鉴定，从江南卷柏中分离鉴定出5个化合物。张沁凌等[25]利用结合1H-NMR和13C-NMR谱图从海南核果木枝叶的正丁醇萃取物中鉴定分离得到11个化合物。邱蓉丽等[26]先采用反复硅胶柱层析、高压制备液相色谱分离纯化等方法分离喜热灵芝实体的12个化合物，再运用1H-NMR技术从喜热灵芝中鉴定出其结构。这都为后续核磁共振技术的标准化研究提供借鉴。

2.2 1H-NMR在植物代谢研究中的应用

核磁共振氢谱技术重现性好，对所有化合物的灵敏度一致，可同一批次检测多种代谢物的同时，还能保证其结构信息的丰富性，并且图谱中的信号峰强度与其浓度成正比，能直接根据相应浓度进行定量分析，这对于植物代谢物的研究意义重大。Ward等[27]采用核磁共振氢谱技术分析不同生态型拟南芥代谢物差异的相关性，在脂肪族物质和碳水化合物中均发现了差异，说明植物代谢物和生态型差异的相关性。Yang等[28]通过核磁共振氢谱技术对不同生长周期的共27个当归(Angelicasinensis)样品进行分析，发现1H-NMR能够清晰地反映出当归植株不同生长时期相应的代谢产物变化。在进行核磁共振检测过程中，有些基团中质子容易与溶剂发生化学变化甚至不含质子，使信号检测不出，高效液相-核磁共振-质谱(HPLC-NMR-MS)联用技术的出现弥补了这些不足，质谱可提供化合物的分子量，碎片峰包含了大量的结构信息。肖超妮等[29]采用液相色谱质谱与核磁共振联用技术(LC-MS-NMR)发现牡丹不同根部位的代谢物组成具有明显差异，对牡丹主根、一级侧根和二级侧根甲醇提取物的1H-NMR谱图进行比较得出不同根部位的代谢物类型大致相似，但是蔗糖(sucrose)和苯乙酰类成分(acetophenones)等代谢物信号强度具有明显差异，该研究为牡丹根皮的等级划分提供了重要的科学依据。

3 核磁共振碳谱(13C-NMR)

核磁共振碳谱不仅可提供有机物碳核类型、核间关系、碳分布信息外，还能区分立体异构体的微细结构。并且13C-NMR能够测定含碳较多的有机物及不含氢的官能团，可反映出氢谱无法反映的结构，如季碳原子结构，羰基等功能基[30]。通过对核磁共振碳谱中有机物主要碳基团化学位移的分析，有机物的碳化学位移主要分为4个部分：烷基碳区(0～50 ppm)、烷氧基碳区(50～110 ppm)、芳香碳区(110～160 ppm)、羰基碳区(160～220 ppm)[31-32]。

3.1 13C-NMR在木素研究中的应用

20世纪70年代13C-NMR开始用于木素结构研究领域，由于13C-NMR图谱化学位移变化较大，获得的光谱吸收峰锐利，可以辨别出结构上的细微差别，因此有利于有机化合物结构的鉴定和图谱的解析[33]。并且13C-NMR能实现对木素的各官能团的定量计算，可比较木素在预处理过程中的结构变化规律以及潜在的断裂机理[34]。张求慧等[35]对杉木和三倍体毛白杨的苯酚液化物进行核磁共振碳谱分析，结果表明2种木材液化后生成物在碳谱中只是在强度上有些差异，化学位移位置变化不大；在毛白杨液化物碳谱中出现的4个化学位移比杉木液化物的谱线强度要大一些，说明毛白杨液化物中的碳原子较多。许凤等[36]通过13C-NMR图谱显示的有机溶剂法获得的麦草木素上碳原子信号峰与木素碳谱中碳的化学位移、强度及归属进行对照，分析得到木素的主要成分为紫丁香基、愈创木基及少量对羟苯基结构单元；酯键连接木素与对香豆酸，酯键和醚键连接木素与阿魏酸。可见13C-NMR不仅可以对木素的结构进行分析，还可以测定其内部的键连方式。异核单量子关系(HSQC)属于NMR谱图中的一种，可探究直接相连的碳氢之间的关系。缪正调等[37]通过13C-1H HSQC谱图对经过不同水热环境处理的核桃壳木素样品进行分析，发现水热处理过程可以使木素和碳水化合物之间的连接键断裂，适当提高温度能提取较高纯度的木素。徐强等[38]通过13C-1H HSQC谱图发现在碱木素侧链区域甲醛和对羟基肉桂酸或阿魏酸单元侧链的双键发生反应形成了羟甲基；在芳香区域和对羟基苯基的C-3、C-5，愈创木基的C-5上发生反应形成了羟甲基。通过HSQC谱图对木素中的结构单元进行辨别以及归属，能够有效探究木素羟甲基化反应过程及改性前后的结构变化。

3.2 13C-NMR在植物化学结构研究中的应用

传统化学提取方法会对原始样品进行热解，导致样品的结构组成信息的损坏。而13C-NMR可以直接分析植物样品中的官能团组成，避免了提取过程中所带来的结构变化问题，其分析结果更接近于真实状态。孙庆雷等[39]发现金银花提取物13C-NMR图谱能鉴别出金银花的特征化学成分，由于金银花提取物的碳谱图具有高度的特征性和重现性，可作为其质量鉴定的相对标准图谱。随后孙庆雷等[40]发现黄芩特征提取物的13C-NMR图谱包含了黄芩提取物中所有物质的碳信号，其特征峰能反映黄芩的特征信号；将黄芩特征提取物的碳谱与其黄酮类主要有效成分碳谱中的特征峰进行比较，即可以了解黄芩的整体面貌，也可以从其局部特征成分进行鉴别和指认。13C-NMR可以直接测量碳骨架，近年来开始用于有机质结构对污染物吸附影响的研究。廖晓勇等[41]利用13C-NMR技术发现蜈蚣草离体鲜根样品中的有机质中比例最多的为烷氧基碳，其次为芳香碳和烷基碳，羧基碳比例较低；但是羧基碳含量随着菲和砷的加入而升高。由于碳谱信号峰重叠机率较小，其图谱的特征信号更容易辨别和指认，逐渐成为鉴别植物样品质量及其结构的有力工具。翁瑞旋等[42]为研究云南束花石斛的化学成分，确定其化学结构，采用核磁共振碳谱和氢谱相结合的方法，通过13C-NMR显示的碳基团化学位移情况和归属所有C、H在结构中的位置，从束花石斛中分离并鉴定了8个化合物。贺鹏等[43]从腾冲红花油菜籽壳80%乙醇浸提物的乙酸乙酯萃取部分中分离得到2个化合物，并根据质谱和核磁共振碳谱分析，2个化合物分别鉴定为齐墩果酸和3β-О-乙酸齐墩果酸。因此，核磁共振碳谱是植物化学结构研究中比较行之有效的方法。

4 其他核磁共振波谱在植物研究中的应用

近年来15N-NMR也成为研究植物的一种手段，然而15N磁旋比小，天然丰度低(0.37%)，因此灵敏度比13C低50倍左右，使得15N-NMR的应用受到一定限制[44]。但由于14N-NMR的化学位移较接近15N-NMR，且14N的丰度接近100%，故14N的灵敏度较高，能在组氨酸结构的研究中得到应用。张永洪等[45]介绍了14N-NMR技术定量分析氮含量的方法，并应用该技术测定了腐殖酸样品中硝酸根离子的含量，定量检测下限可达毫摩尔级(mmol·L-1)。

氧是地壳中含量最多的元素，占到48.06%。17O作为唯一具有核磁共振信号的氧同位素，其化学位移范围很宽，而且由于是四极核，在NMR图谱中除了化学位移作用，还可以利用核的四极相互作用和电场梯度灵敏地考察区分17O原子核周围化学环境的变化信息[46]。沸石是最重要的固体氧化物材料，最早用于研究17O核磁共振技术[47]。虽然17O-NMR提供了丰富的结构信息，但是17O的自然丰度很低(0.037%)，因此17O核磁共振研究需要进行昂贵的同位素富集，而且其富集方法还没有一套合适的方法[48]，故17O在植物科学研究中的应用较少。

5 存在问题及展望

核磁共振技术在植物科学领域取得了一系列令人瞩目的成就，逐渐成为学者关注的重点。但仍存在一些问题，有待进一步解决和改进。

1)信号重叠是植物提取物中复杂光谱的一个问题，妨碍了提取物的识别和量化，因此需要更好的信号分辨率。多维核磁共振波谱法的共振信号分别在多个独立的频率轴上传播，从而减少了信号重叠，但多维核磁共振波谱法的局限是采集时间较长。近年来报道了一种称作Hadamard谱的快速多维谱方法[49]，在相同的分辨率和信噪比的前提下，基于Hadamard的信号采集时间比传统方法减少约20倍，因此Hadamard谱或许会成为新的研究趋势。

2)多种检测技术相结合拓展了NMR在植物研究领域的应用，不仅简化了样品前处理过程，而且能够提高自动化程度，全面准确地发掘更多信息，例如LC-NMR技术、LC-SPE-NMR和LC-MS-NMR技术等，但NMR常规的室温探头检测灵敏度只有毫克级，而色谱、质谱达到了微克级，限制了联用技术的广泛应用。针对这一问题，使用超低温微量探头及提高磁场强度可较好的解决这一缺陷[50]，探头类型相同的情况下，600 MHz比200 MHz谱仪的31P、1H、13C 3种核的检测灵敏度提高约3～7倍，同时，使用超低温微量探头比同频率的常温探头的检测灵敏度高3～5倍。

3)数据库的建立对于植物研究中数据的可持续使用和挖掘至关重要。与其他平台相比，NMR生成的数据在其重现性方面更加可靠。每当测量出一个植物的NMR图谱数据时，就可以加入数据库，与之前获得的相同植物的数据用于进一步的数据挖掘，但前提需要相同的萃取过程，定义和标准化样品分析的所有步骤，以避免化合物的共振变化。

4)由于核磁共振仪器成本和维护费用较高，一定程度上限制了该技术在植物科学上的应用。今后我们需要提高核磁共振仪器性能，加强技术人员的培训，以降低仪器成本，并且争取实现仪器共享，必将促进核磁共振技术在植物研究方面的进一步提高。

5)核磁共振作为一种植物结构分析的常用技术，已应用到植物生理发育和结构鉴定等方面，目前逐渐深入运用NMR开展不同植物生理生态学结构与功能方面从宏观到微观层次的研究。有关NMR在植物活细胞的生物功能、基因功能和代谢作用，植物根系对养分及盐分胁迫信号感受转导与其他信号途径互作关系的研究也亟待深入。