鱼类低温耐受机制与功能基因研究进展

刘丽丽 朱华 闫艳春 王晓雯 张蓉 朱建亚

（1. 北京市水产科学研究所 渔业生物技术北京市重点实验室，北京 100068；2. 中国农业科学院研究生院，北京100081）

作为变温动物，鱼类广泛栖息于不同的温度环境中。广温性鱼类具有较强的温度适应能力，当栖息在低温时，能通过调节不同代谢途径的酶浓度、转换代谢途径和改变其组织细胞的分子组成，使代谢和生理功能逐渐适应低温；狭温性鱼类只能适应很窄的温度范围，温度变化，特别是低温会导致鱼类免疫力下降，容易生病甚至死亡，这是鱼类长期适应环境和进化的结果。由于鱼类重要的生态意义和经济价值，已将组学技术大量用于研究温度等环境因素对鱼类基因表达的作用，以解析鱼类对温度的适应机制［1-3］。本文将回顾鱼类适应长期低温环境和响应短期低温胁迫的组学研究报道，总结鱼类低温耐受的遗传进化基础和不同鱼类在低温胁迫下的转录表达差异，根据功能对鱼类低温耐受相关基因进行分类讨论，并预测本领域研究热点，以期为后续研究提供思路。

1 鱼类低温耐受的分子机制

1.1 鱼类低温耐受的遗传进化基础

鱼类适应寒冷环境的一种主要手段是在进化过程中获得功能基因。栖息于南极圈和北极圈的极地鱼类能够长期在零下低温环境中生存，也称为抗冻鱼，为研究鱼类耐受低温的遗传进化机制提供了绝佳的生物材料。研究发现，抗冻鱼在进化过程中，通过基因重组和突变获得了一些关键功能基因，如特异性地获得抗冻糖蛋白（Antifreeze glycoprotein，AFGP）。AFGP能够结合并抑制冰晶生长，保护细胞和血液在冰点下不结冰，支持低于冰点温度的正常代谢［1］，保证抗冻鱼在极地环境正常生存；不同抗冻鱼AFGP蛋白在分子组成和结构上很相似，但其编码基因的来源完全不同，南极美露鳕（Dissostichus mawsoni）afgp基因起源于胰蛋白酶原基因，而北极鳕鱼（Boreogadus saida）afgp基因起源于胰蛋白酶原基因以外的基因位点［2］。

抗冻鱼在进化过程中同时丧失了一些基因的功能，如丧失向线粒体输送氧气的血红蛋白基因［3］。血红蛋白基因在抗冻鱼基因组中发生了普遍性的缺失：渊龙鰧科（Bathydraconidae）等南极鱼的血红素蛋白基因表达水平非常低；鳄冰鱼科（Channichthyidae）中至少16种冰鱼完全缺失血红素蛋白基因，冰鱼β球蛋白基因在进化史上两次发生基因重组，这两次突变都导致了该基因位点的失活［4］。

鱼类为了适应寒冷环境还发生了大规模的基因扩增。寒冷环境下LINE基因家族在多种南极鱼中都发生了大规模扩增［5］；冰鱼中与线粒体生物合成和有氧呼吸相关的基因重复显著增多，从而提高低温下氧气的运输和利用效率［6］。通过转录组学和基因组学分析发现，南极美露鳕（Dissostichus mawsoni）有177个非冗余蛋白家族的丰度高于热带鱼对应蛋白丰度，使机体适应极端寒冷环境。这177个蛋白家族主要包括蛋白质生物合成、蛋白折叠和降解、脂质代谢、抗氧化、抗凋亡、先天免疫及绒毛膜形成等。比较基因组研究发现上述很多基因的高表达是通过大规模的基因扩增实现的，极稳定的低温环境所导致的低代谢并没有使鱼类基因组中基因的含量降低，相反是普遍扩增，特别是逆转录系统扩增了近300倍。这些研究表明大规模基因扩增可能是鱼类适应永恒低温环境的一个重要和普遍的进化机制［5］。

1.2 鱼类低温耐受的遗传信息表达机制

1.2.1 低温下转录表达的种间、种内差异 2004年，Gracey等［7］以鲤鱼（Cyprinus carpio）为模型第一次在转录组水平上开展鱼类低温胁迫研究，将鲤鱼在30、23、17和10℃分别暴露22 d后发现，在260个上调表达基因中，有27个基因的直系同源基因在酵母低温胁迫时也上调表达，说明从单细胞到多细胞生物的低温耐受机制存在保守性。对革首南极鱼（Notothenia corriceps）、头带冰鱼（Chaenocephalus Aceratus）和侧纹南极鱼（Pleuragramma antarcticum）脑组织和肝脏组织的转录组测序发现，南极鱼类可能普遍富含蛋白质泛素降解途径相关基因的转录本［8］。短头壮绵鳚（Pachycara brachycephalum）转录组测序发现，在不同温度下的差异表达基因主要集中在信号传递、转录后修饰、细胞骨架重建、代谢转换及转录和翻译等细胞过程；低温下抗氧化酶基因的转录本水平也上调表达，以应对低温导致的氧化应激［9］。与常温（28℃）相比，低水温（16℃）处理下斑马鱼（Danio rerio）幼鱼转录组RNA 加工、细胞金属离子稳态、蛋白转运相关的基因也出现了显著上调表达［10］。这些数据说明，生活在不同温度下的鱼类应对低温胁迫的信号通路存在相似性。

然而不同鱼类适应低温胁迫的分子机制依然存在明显的种间差异。生活在极地环境的南极美露鳕转录组表现出明显的低温适应性，其编码蛋白质合成、折叠和降解的基因、与脂质代谢、抗氧化、抗凋亡和免疫相关基因的表达水平都显著高于热带模式生物斑马鱼（Danio rerio）［5］。另一个例子是PI3K/AKT/GSK-3β信号通路，该通路在鱼类低温胁迫和适应中发挥了重要的作用，其相关基因在草鱼、斑马鱼和罗非鱼低温胁迫中都表现出差异表达，但是低温下AKT和GSK-3β蛋白在3种鱼间呈现出不同的表达模式和表达水平的变化［11］。即使同一种鱼，不同品系之间也存在耐寒性能的差异，以红罗非鱼（Oreochromis niloticus）为例［12］，关岛品系的平均半数致死温度（LT50）为7.46℃，佛罗里达品系LT50为6.77℃，珍珠白品系LT50最低，为6.68℃；3个不同品系红罗非鱼群体开始出现死亡时最低死亡温度由高到低依次是关岛品系＞佛罗里达品系＞珍珠白品系，暗示不同品系之间红罗非鱼的低温耐受机制存在差异。即使同一品种鱼类，胚胎发育阶段的环境温度不同，长大后适应温度的能力和范围也不同，低温胁迫时也表现出转录组差异［13］。

1.2.2 低温下转录表达的组织特异性 不同组织的低温耐受具有转录组水平的差异性。骨骼肌组织中，肌节结构和肌肉收缩相关基因存在共表达，表明肌肉组织在应对低温胁迫时可能存在结构重建，而心肌组织则没有这种现象；糖酵解基因在脑组织上调表达而骨骼肌组织中普遍下调［7］。大黄鱼肝脏转录组发现，RNA转录、蛋白质与氨基酸代谢、脂类与固醇代谢、碳水化合物代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环等能量和代谢通路相关基因在低温和高温胁迫下显著差异表达［14］。金头鲷低温（6.8℃）处理3周后，肝脏转录组的差异表达基因富集到脂类代谢、能量代谢和蛋白质变性等通路。此外，还发现未折叠蛋白质在内质网应对低温胁迫时的发挥作用［15］。低温下，虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss，TCO品系）鳃组织发现蛋白质失活、冷诱导性细胞死亡和离子转运相关基因的上调表达［16］。而伯氏肩孔南极鱼（Trematomus bernacchii）头肾组织转录组差异表达基因主要集中于免疫应答通路［17］。由于各组织结构生理功能的差异，应对低温胁迫时的生理生化反应各不相同，所以在耐受低温时表现出组织特异性转录表达。最近，越来越多的研究者开始关注组织特异性转录组［18-20］。

1.2.3 低温胁迫下的转录调控网络 Hung等［21］通过RNA-seq技术研究发现，低温胁迫下，斑马鱼幼鱼（96 hpf）差异表达miRNA和差异表达mRNA富集到相同的信号通路，主要包括黑色素原生成、GnRH、生物钟通路等。其中生物钟通路相关基因per2有助于斑马鱼幼鱼在冷刺激后恢复正常，而在低温胁迫下dre-mir-29bmiRNA能够调控per3的表达，说明miRNA通过调控基因表达模式使斑马鱼幼鱼适应低温胁迫。低温胁迫下，斑马鱼剪接体编码基因也出现显著上调表达［22］。

罗非鱼和斑马鱼的适宜生存温度都是28℃，但是其低温适应调控机制具有显著的差异。在同一低温环境处理下，尽管两种鱼类中都发现Fox信号参与调控的代谢与凋亡通路，但是斑马鱼鳃细胞凋亡出现的时间更晚、程度更温和。进一步研究发现，在两种鱼类中参与调控细胞凋亡的基因不同，同源基因的表达模式不同，参与调控凋亡途径的顺式和反式调控因子也不同［23］。

顺式作用元件AGMAACA能够与Bcl2作用因子结合，SAGTTC是AP-1的结合位点，反式作用因子结合到基因上游的顺式作用元件结合位点，调控基因转录表达。在热带鱼类罗非鱼和斑马鱼基因组中分别鉴定到47和119个上游包含这两个结合元件的基因；而大西洋鳕鱼、鲤鱼、河豚等亚北极圈和温带的鱼类基因组中，含有这两个结合元件的基因数量较少［24］。表明顺式作用元件AGMAACA和SAGTTC可能参与热带鱼类应对低温胁迫的分子调控网络。

长期低温胁迫使鱼类在表观遗传水平上产生适应性。经过连续多代的低温胁迫可导致尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）DNA甲基化水平发生改变，发生去甲基化反应，基因组甲基化程度降低，说明DNA甲基化与罗非鱼抗寒性反应密切相关［25］。当前，鱼类如何基于表观遗传学修饰适应和对抗低温环境，尚未展开广泛研究。

2 鱼类低温耐受相关功能基因

2.1 鱼类抗冻（糖）蛋白基因

在极地鱼类中发现的抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）和AFGP是研究最早、最深入的两个抗冻蛋白。最早发现的抗冻蛋白包括来自美洲拟鲽（Pseudopleuronectes americanus）的Ⅰ型AFP、来自美洲大绵鳚（Macrozoarces americanus）的Ⅲ型AFP和来自大西洋鳕鱼的AFGP等［26］。AF（G）P对冰晶具有较高的亲和力，能够附着到冰晶表面，阻止冰晶长大［27］，因此表达AF（G）P的鱼类能够在低于血浆冰点的温度下生存，而血浆不凝固，达到抗冻效果。

鉴于AF（G）P蛋白良好的抗冻能力，研究人员通过各种手段将AF（G）P蛋白或基因转到鱼类及其他物种中，希望提高受体的耐寒性能。早在1999年，Hobbs［28］将AF（G）P蛋白注射到金鱼（Carassius auratus L.）中，发现注射后金鱼对低温的耐受时间和耐受的温度阈值没有明显变化。大西洋鲑鱼（Salmo salar）的最佳生存温度是17℃，Fletcher等［29］将afp基因转到大西洋鲑鱼中，并稳定遗传5代，在后代基因组DNA和血液中均能检测到afp，但是其表达水平十分低。将afp基因整合到大西洋鲑鱼基因组上，尽管在不同组织中都检测到afp转录本或者前体蛋白的表达，但是转基因大西洋鲑的耐低温性能没有明显改善［30-32］。而Begis等［33］将afp基因整合到小鼠基因组，发现转基因小鼠的睾丸和卵巢组织在4℃的抗冻能力明显高于普通小鼠。这些研究说明，由于AF（G）P的冰晶吸附特性，其抗冻能力在接近冰点温度下发挥作用，当温度远高于冰点温度（如17℃）时，AF（G）P没有显著的耐寒性能。

2.2 鱼类分子伴侣基因

许多研究认为热激蛋白HSP蛋白家族在鱼类的耐低温机制中发挥关键作用。HSP70是典型的诱导型表达蛋白，然而Place等［34］发现在伯氏肩孔南极鱼、博氏南冰鰧（Pagothenia borchgrevinki）、南极绵鳚（Lycodichthys dearborni）等南极鱼中，HSP70基因普遍表现为高水平的组成型表达，表明HSP70在鱼类应对长期低温环境中发挥重要作用。三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）在8℃处理9周后，其肝脏和胸肌中HSP70转录本水平和蛋白质丰度比20℃对照组显著上调［35］；达氏鲟（Huso dauricus）的适宜生存温度为16℃，将温度分别调节至25、10和4℃，发现4℃时HSP70转录本水平最高，而在25℃时很少表达，表明HSP70和HSP90对冷应激更敏感［36］；将南亚野鲮（Labeo rohita）HSP70开放阅读框的cDNA插入表达载体，发现HSP70能够增强大肠杆菌、小鼠骨髓瘤细胞和鱼肝癌细胞应对低温胁迫的能力［37］，表明鱼类HSP70具有耐低温的潜能。

HSP60蛋白家族中有一类伴侣蛋白CCT（Chaperonins containing TCPl），真核生物CCT蛋白是双层环构成的柱状复合体，每层环包含8个序列相关的TCP1亚基，分别由8个基因编码。CCT包含数个ATP结合基序，能够结合并水解ATP产生能量，帮助蛋白组装、折叠和异位［38］，在机体应对逆境时参与细胞微稳态，在保护细胞应对损伤和其他胁迫中发挥作用［39］。研究已经证实，TCP1与机体低温耐受能力相关。当温度从22℃逐渐下降到12℃，尼罗罗非鱼的tcp1-beata和tcp1- eta基因表达水平分别上调为对照组的12.2和10.7倍［40］，马来西亚红罗非鱼tcp1-beata和tcp1- eta基因在低温下表现出相同的趋势［41］。

冷诱导RNA结合蛋白（Cold-inducible RNA-bingding protein，CIRP）是亚低温环境中最早的应激产物之一［42］，参与机体抵御外界低温的过程，提高mRNA的稳定性，介导蛋白质翻译过程［43］，保护机体免受低温胁迫。目前已克隆了大西洋鲑、斑马鱼、虹鳟及牙鲆（Paralichthys olivaceus）等鱼类cirp基因的编码序列［44-45］，序列比对分析显示与哺乳类、两栖类的cirp基因有较高的保守性，可能参与低温、渗透压等胁迫下的应激调节［46］。

2.3 鱼类能量/物质代谢酶基因

低温下细胞膜的流动性降低，导致细胞功能损伤，因此造成各种应激性生理反应。硬脂酰辅酶脱氢 酶 1（Stearoyl-Co enzyme A desaturase 1，SCD1）能够在低温下参与脂肪酸代谢，调节膜的流动性［47］，大量研究发现SCD1在鱼类应对低温胁迫中具有关键作用：草鱼（Grass carp）肝脏中scd1表达水平在15℃处理21 d后开始上升［48］；尼罗罗非鱼冷诱导7 d后scd1 mRNA水平上升了16倍［49］；鲤鱼从30℃逐渐降到10℃后，SCD1水平上升了8-10倍［50］；大黄鱼（Larimichthys crocea）最适生长温度为15℃，当温度下降至7℃时，肝脏和大脑中SCD1含量显著上升［51］。SCD1对脂肪酸（16∶0和18∶0）有强烈的去饱和作用［52］，低温下活性SCD1表达水平上升，不饱和脂肪酸比例增加，细胞膜保持一定的流动性，从而使鱼类低温耐受能力增强。

鱼类体内其他一些能量和物质的代谢酶也参与应对低温胁迫。体外实验发现，南极美露鳕液泡型ATP酶C亚基编码基因（atp6v0c）过表达能够显著降低低温胁迫条件下HeLa细胞死亡率［53］，说明鳞头犬牙南极鱼atp6v0c可能具有耐低温的潜能。谷胱甘肽硫-转移酶M（Glutathione S-transferases M，GSTM）能够清除脂类自由基，抑制过氧化反应。转录组测序表明低温下斑马鱼gstm转录本水平上调［54］，分析斑马鱼gstm的单核苷酸多态性，发现gstm第1个内含子的基因型与斑马鱼低温耐受性显著相关［55］，说明gstm可能是鱼类低温耐受相关功能基因。

2.4 鱼类膜通道蛋白基因

低温胁迫下，细胞膜流动性降低，膜通道蛋白运输能力减弱，细胞内外能量和物质运输受阻［56］。水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一类疏水性膜通道蛋白，介导自由水分子的被动跨膜转运，参与小分子气体交换和运输［57］，对保持细胞内外环境的稳态平衡起着重要的作用［58］。朱华平等［59］以尼罗罗非鱼耐寒品系为材料，克隆分析水通道蛋白基因（aqp1）的cDNA序列发现，aqp1表达水平能被低温胁迫显著抑制，而且表达量在耐寒品系肌肉组织和对照组中差异显著，表明aqp1 基因在罗非鱼低温适应过程中发挥重要作用。

当前，尽管在鱼类中发现了一些与低温耐受相关的基因，但是这些基因在不同物种/组织间的特异性鱼低温胁迫下的特征表达谱尚不完善，其在低温胁迫响应机制中的作用尚不明确，挖掘鱼类低温耐受相关功能基因及其应用，还需要更多研究。

3 未来研究热点

低温耐受分子机制与功能基因挖掘。受益于高通量测序技术，鱼类低温耐受的分子机制研究发展势头良好，然而由于鱼类种群庞大、生存地域广泛、温度适应性差异巨大，不同品种耐受低温的能力和信号通路各不相同［23］，全面揭示鱼类低温耐受的分子机制，还需要大量基础性研究工作。与此同时，低温耐受功能蛋白在农业生产、食品加工和医学领域的应用前景不可估量，然而目前仅AF（G）P研究较为深入；鱼类低温耐受功能基因挖掘和应用研究将成为未来研究热点之一。

基因编辑分子育种。将低温耐受相关基因引入受体生物基因组，可以改善转基因生物的耐寒抗冻能力，然而转外源基因的鱼类在公众认可度和环境释放保护等方面还有很长的路要走［60］。依赖于最新的基因编辑技术，对鱼类基因组内源性基因碱基序列进行编辑，不引入可遗传外源基因的技术手段，可能为鱼类耐低温品系的分子育种提供新的思路。

低温耐受功能蛋白的人工合成和结构模拟。由于独特的结合冰晶的能力，AF（G）P在食品冷冻、水产品的低温存储［61］和器官、细胞的医用冷存［33］等领域有广泛的应用前景。目前AFP可通过重组蛋白产生，而AFGP尚只能通过人工合成获得少量纯蛋白，蛋白结构模拟与人工合成研究将成为AF（G）P大规模应用的限速步骤［62］。

相关功能蛋白作为食品/饲料添加剂。将AFP蛋白作为饲料添加剂喂食罗非鱼（Oreochromis mossambicus Peters） 和 虱 目 鱼（Chanos chanos Forsskal）幼鱼，能够在一定程度上提高幼鱼在低温下的存活率［63］；而以添加南极美露鳕钙调蛋白（Dm-CaM）的商品饲料喂食点带石斑鱼（Epinephelus coioides）6周后，急性低温胁迫发现其免疫能力没有明显的改善［64］。低温耐受相关功能蛋白作为添加剂的应用具有不稳定性，可能是由于功能蛋白必须定位在细胞膜等靶标位点才具有活性作用，而蛋白添加剂在体内被消化降解或者排出体外，不能以活性形式达到靶标位点。因此，小分子功能肽和人工修饰的靶向蛋白将促进低温耐受功能蛋白作为饲料添加剂的应用。