肿瘤干细胞及其微环境研究现状和调控策略

郝芳芳， 赵同军， 封 贺， 王建莉， 展 永

(河北工业大学 理学院 生物物理研究所， 天津 300401)

肿瘤的发生是涉及多种因素非常复杂的过程，近年来这方面研究取得了长足的进展。研究认为在致癌因素刺激下或自发条件下细胞发生基因突变，而这种在基因水平上失去正常自我调控的细胞转化为肿瘤干细胞(CSCs)，CSCs在机体组织内经过一系列克隆性增殖以及分化形成肿瘤[1]。1997年John Dick等人首先确认在急性骨髓性白血病患者体内存在CSCs，随后在其他原发性肿瘤组织和细胞系也检测到CSCs[2]。CSCs在肿瘤发生、发展及复发等过程中起关键作用。而实验研究表明CSCs生长依赖于其所在的微环境。CSCs微环境能够维持其干性并调控其分裂模式，而且与癌细胞侵袭和肿瘤复发密不可分[3]。因此CSCs及其微环境相关的问题受到了广泛的关注，也成为肿瘤靶向治疗等临床研究的重要研究领域。针对CSCs生长的微环境调控策略，有望成为肿瘤靶向治疗的有效手段[4-6]。本文就肿瘤和正常组织干细胞及其微环境以及微环境可能的调控策略加以综述。

1 CSCs的起源及特性

CSCs是存在于肿瘤细胞群体中能够自我更新和分化进而补充各个种系癌细胞的细胞小子集，与普通干细胞共享相似的基因表达谱系，并且与肿瘤发生、发展、转移及复发等过程紧密相关[5-7]。然而CSCs的起源至今仍存在争议。一种观点认为CSCs可能来源于发生基因突变并丧失了增殖控制的正常干细胞，另一种观点则推断CSCs可能来源于发生基因突变并获得类似干细胞自我更新能力的分化细胞[1,8]。但多数人倾向于肿瘤干细胞CSCs来源于正常干细胞突变这一理论[6,9]，并认为肿瘤的发生是干细胞突变增殖的结果，其后代共享突变特性。

虽然CSCs具有类似于正常干细胞的无限增殖和转移能力，但是在自我更新、分化、信号通路、微环境依赖性、特定的致癌/抑癌基因表达等方面与正常干细胞存在明显差异[1]。CSCs的行为总是依赖于特定的微环境，受微环境的调控，其分化增殖产生的癌细胞能够转移到多种组织并形成异质性肿瘤，使正常组织和器官受到破坏，功能发生异常[1,10]。基于CSCs与正常干细胞的共有特征及独特差异，研究CSCs生长机制，可以加深对CSCs的认识并为研究针对CSCs的肿瘤高效靶向疗法提供参考。

2 正常器官和异常肿瘤组织中的干细胞微环境

2.1 骨髓中的正常干细胞微环境

对哺乳动物骨髓中造血干细胞(HSCs)的广泛研究使人们认识到影响HSCs增殖的微环境是非常复杂的，存在多方面的因素。首先，胚胎中动脉腔内HSCs 的增殖受到血管微环境维护与支持，如背侧主动脉和脐肠系膜动脉腔内的HSCs增殖就依赖于特定的血管微环境[3]。其次，骨内膜区域的成骨蛋白(BMP)信号抑制和甲状旁腺激素受体激活能够诱导成骨细胞增殖，并最终导致HSCs增殖。因而认为成骨细胞可能是HSCs微环境的重要组成部分，参与调节HSCs数量[11]。另外，受体酪氨酸激酶(Tie2)在HSCs上表达，由整合蛋白激活，其功能是参与动脉中HSCs对内皮细胞(ECs)的黏附，因而也被看作CSCs微环境的组成部分[12]。这里，成骨细胞产生的血管生成素-1活化Tie2，活化的Tie2诱导HSCs休眠[11-12]，这种休眠被认为是通过由N-钙黏蛋白介导的HSCs和成骨细胞之间的强烈黏附而实现的，但N-钙黏蛋白是否参与目前还存在争议。

关于HSCs微环境的研究最近不断取得新进展。在胚胎中观察到HSCs位于骨髓血窦区域并黏附在网状组织细胞上，网状组织细胞通过趋化因子受体 (CXCR)4表达趋化因子配体(CXCL)12/ 基质衍生因子1[13]。而CXCR4的缺乏会导致HSCs数量减少，所以该受体-配体系统可能参与HSCs数量调控，是HSCs微环境的重要因素。细胞外因子(Wnt)作为微环境因素以特定方式调控HSCs休眠和自我更新的干细胞特性[14]。比如flamingo-和跨膜受体8介导的非经典Wnt信号传导通路诱导HSCs休眠，β-连环蛋白介导的典型Wnt通路在血管生态位中诱导HSCs自我更新[14]。有报道雪旺细胞也可能是骨髓中HSCs微环境的组成成分。该细胞能够将潜在的转化生长因子(TGF)β转变为活跃状态，并诱导HSCs休眠。雪旺细胞定位在血管区域，可能诱导HSCs的自我更新以及休眠[15]。

2.2 肿瘤组织中的CSCs微环境

类似于正常组织的干细胞，CSCs自我更新和分化增殖也依赖于特定的微环境。近期研究显示CSCs微环境包含的因素很多，如Wnt、间质细胞、再生血管以及炎症细胞。这些微环境因素相互影响共同调控CSCs的分裂分化休眠等过程，维持CSCs的干性，在肿瘤发生发展等过程中发挥着独特作用。这启发人们通过各肿瘤组织中CSCs微环境的研究来设计高效抑制CSCs存活的肿瘤治疗方案。借鉴骨髓中的正常干细胞微环境的研究方法与思想，探究结肠癌、乳腺癌、白血病以及癌细胞接种模型中CSCs微环境机制，寻找不同肿瘤组织中CSCs共同性和差异性以及可能的调控策略已成为当前研究的热点。

2.2.1 结肠癌组织中的CSCs微环境

肠道干细胞位于肠隐窝底部，通常在上皮细胞和肌成纤维细胞附近自我复制更新，而这种复制是通过Wnt信号通路机制介导实现的[1,3,16]。

结肠癌中，CSCs的定位目前尚不完全清楚。已有的证据表明，具有核β-连环蛋白的癌细胞通过核β-连环蛋白介导的正常Wnt信号通路，在癌细胞侵袭前期与肌成纤维细胞形成局部集中的细胞群体，因而有理由推断这种癌细胞可能就是结肠癌中的CSCs，而肌成纤维细胞则构成了CSCs实现功能所依赖的微环境。需要指出的是，在癌细胞接种模型中，I型胶原将癌细胞转化为CSCs，而胶原蛋白主要在肌成纤维细胞中被观察到，这也进一步印证了这一推断。而当肌成纤维细胞被CD8+T淋巴细胞诱导凋亡时，肿瘤生长和转移会受到抑制，因此肌成纤维细胞的确有可能是结肠癌CSCs微环境的重要组成部分[3]。

细胞间Wnt信号活性的可视化已成为识别CSCs的新技术。借助于这项技术，最新的研究发现来源于肌成纤维细胞的肝细胞生长因子(HGF)能够增强孤立的CSCs的Wnt信号，这有力地说明作为微环境肌成纤维细胞对于CSCs各项活动有明显支持维护作用。进一步研究表明，骨髓中由纤维细胞分化产生的肌纤维细胞，作为CSCs生长微环境能够表达基质金属蛋白酶(MMPs)2和蛋白酶(MMPs)9，并诱导CSCs向恶性肿瘤细胞分化[16]。

此外，ECs在肿瘤中产生的可溶性凹口配体诱导结肠癌CSCs的干性，因而被认为是结肠癌干细胞微环境不可或缺的组成部分[17]。

2.2.2 乳腺癌组织中的CSCs微环境

乳腺癌实体瘤中的CSCs于2003年被首次报道。研究结果表明10%的癌细胞是CD44+、CD24-和EpCAM+细胞，CSCs就存在于这些细胞当中。CSCs具有致肿瘤能力并能增殖形成肿瘤球[3,6]。在之后的研究中CSCs与炎症之间的联系也受到关注。

在乳腺癌发生过程中，各种Wnt参与肿瘤的发生并发挥重要作用。核因子kB(NF-κB)是一种重要的Wnt。在NF-κB参与的调控过程中，Src诱导白介素-6(IL-6)下游NF-κB活化，进而激活信号转导及转录激活蛋白(STAT)3，最终导致NF-κB活化从而形成正反馈。这些Wnt作为微环境通过相互作用共同促进乳腺癌中CSCs的发展。

在乳腺癌治疗过程中，抗癌药物造成癌细胞损伤，所产生的IL-8会刺激CSCs上的CXCR1，诱导CSCs的抗性，反而有利于CSCs的存活[18]。此外，肿瘤和基质外来体通过维甲酸诱导基因-1(RNA传感器)促使CSCs产生(STAT)1[18]。而且如在其他癌症中观察到的那样，由基质细胞产生的锯齿状蛋白1(JAG1)会诱导CSCs相关特性的活化。这些蛋白能够维持CSCs干性。然而，在几种类型的乳腺癌中, 相关的CSCs扩增只发生在基础亚型。

2.2.3 白血病组织中CSCs微环境

研究发现在急性骨髓性白血病中存在白血病干细胞(LSCs)[1,3]。LSCs表达T细胞免疫球蛋白、黏蛋白和(或)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体等膜蛋白[3]。如在正常骨髓HSCs中观察到的那样，LSCs定位于能大量观察到成骨细胞的区域，在骨内膜这样的微环境中，LSCs被诱导休眠。最近报道巨核细胞可以通过提供TGFβ、FGF1和促血小板生成素作为微环境因素来维持HSCs干性[3]。而研究表明除末端分化细胞外，慢性LSCs衍生的柱状细胞样的细胞也是LSCs微环境的组成部分。

多发性骨髓瘤中的B淋巴细胞系细胞集聚在骨髓处而不是淋巴结处。在此肿瘤微环境中，成骨细胞、间充质祖细胞和活化的破骨细胞数量较少，但能观察到大量血管，这些血管微环境促进CSCs增殖。因此表明血管微环境是促进CSCs生长增殖主要微环境因素。

2.2.4 癌细胞接种模型

研究表明休眠状态的CSCs通常与肿瘤复发相关，因此休眠状态CSCs的调控方案对于预防肿瘤复发至关重要[3]。而活化状态的CSCs通常与癌细胞扩散联系紧密，针对这一问题，如何设计高效的CSCs靶向疗法并将其应用于肿瘤治疗及预防恶化是目前癌症治疗的研究热点之一。

研究人员在比较有较高自我更新活性的胚胎HSCs和成熟休眠HSCs的基因表达时，发现与合成致死突变体(SLD)共同起作用的配偶体(PSF1)在活性HSCs上表达[19]。虽然PSF1的功能尚未得到精确的阐明，但可以确定的是PSF1在未成熟干细胞的增殖中起重要作用，因为PSF1缺陷小鼠由于缺乏外胚层细胞增殖而显示出胚胎致死性[19]。HSCs快速增殖对骨髓重建的失败，会导致7天内小鼠100%致死[19]。人类胚胎干细胞(ESC)能表达SLD5，且PSF1表达与人类前列腺癌的组织学恶性程度相关。总之，PSF1和SLD5参与未成熟干细胞的增殖，可作为检测活性CSCs的标志物。

基于以上证据，在PSF1启动子的转录控制下，通过增强的绿色荧光蛋白 (EGFP)达到对PSF1阳性癌细胞的可视化。发现与低PSF1癌细胞相比，EGFP阳性癌细胞具有更高的致瘤性、转移性和侵袭性，并且在基因表达方面显示出ESC样信号[19]。在癌细胞接种小鼠模型中PSF1可以标记活化状态CSCs。而PSF1标记的高阳性癌细胞定位在人类和小鼠肿瘤模型组织中的血管附近。这表明血管微环境支持CSCs的干细胞活性。

3 CSCs微环境调控

CSCs微环境方面的研究使人们对于肿瘤发生发展机理的认识越来越深入，启发人们探索肿瘤治疗的新途径。针对 CSCs开发的分子靶向药物作用于机体时会诱导细胞的药物外排泵功能，降低细胞对药物的敏感性，使之产生耐药性，不能杀死所有CSCs[3]。因此CSCs的耐药性是癌症治疗过程中迫切需要解决的问题，也是有效抑制肿瘤的关键。而利用CSCs特异性表达靶向分子的免疫疗法，通过调动机体的免疫系统，增强机体的抗肿瘤免疫力来达到抑制和治疗肿瘤的效果，有可能是治疗肿瘤的有效途径。除此之外，考虑肿瘤微环境，通过微环境实现对CSCs的调控，从而抑制肿瘤发展或延迟复发也可能是实现有效治疗肿瘤的方案之一[20]。由于已分化癌细胞对抗癌药物比CSCs更敏感，还可以通过诱导CSCs分化为癌细胞然后再进行肿瘤治疗，而这种诱导分化可能通过改变肿瘤微环境以及抑制干细胞因子来实现。

药物在肿瘤治疗时被输送到治疗区域发挥作用，但在此期间CSCs通过与微环境相互作用获得耐药性，因此，这种互动的中断对于肿瘤治疗至关重要。在微环境调控方面，消除微环境因素可能会对正常细胞产生严重的副作用，如血管破裂导致无效的药物递送和缺氧，诱导癌细胞的恶性发展[3]。因此肿瘤脉管系统的正常化可能是最好的解决方案。此外，由于M2巨噬细胞促进肿瘤发展，而M1巨噬细胞抑制癌细胞增殖，所以应该选择将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞的肿瘤治疗策略。因为周细胞的损失促进癌细胞(可能是CSCs)的转移，周细胞对ECs的紧密黏附可能阻断癌细胞转移，所以周细胞是抑制CSCs转移的微环境调控对象。因此，可以通过多种途径来调控CSCs微环境，并通过微环境精密监控达到对CSCs靶向治疗。

4 结论与展望

CSCs微环境中的Wnt、间质细胞、再生血管及炎症细胞维持CSCs干性并调控其分裂机制，参与肿瘤发生、发展、转移及复发等多种过程，在结肠癌、乳腺癌、白血病等癌症病变中均有体现。微环境方面的研究使人们对于肿瘤发生发展机理的认识越来越深入，也启发人们探索肿瘤临床治疗的新途径。癌症治疗传统方法虽能短时间内杀死大量癌细胞，但造成机体组织损伤，并对初次治疗后的肿瘤短时间内急剧复发埋下祸端。而CSCs微环境相关疗法，有望在大量研究及临床验证后，实现与肿瘤传统疗法相结合，从而在癌症治疗过程中有效杀死癌细胞、限制CSCs数量并延迟或预防肿瘤复发。