无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用

赵悦 朱巍巍 刘锦燕 孟玲宁 王珏婷 李文静 项明洁

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

无绿藻 (Prototheca)作为一种3～30 μm的单细胞条件致病菌，通常情况下，定植于人体的指甲、皮肤、呼吸道和消化系统[1]。目前，生物学将无绿藻归为：绿色植物界、绿藻门、Trebouxlophyceae纲、绿藻目、绿藻科、无绿藻属。该属包含6个种[2]：Protothecastagnora、Protothecaulmea、Protothecablashkeae[3-4]、Protothecawickerhamii、Protothecacutis[5]、Protothecazopfii[6]，后4种对人和动物具有致病性。

近年来，由于临床免疫抑制治疗，广谱抗生素、皮质类固醇激素的大量使用和滥用以及艾滋病、接受器官移植[7]、干细胞移植[8]、白血病[9]、多发性骨髓瘤[10]、恶性肿瘤和糖尿病[2]患者的增多，无绿藻的感染率也逐年上升。因此，深入细致地研究无绿藻的分型方法，对研究无绿藻的致病性和流行病学特征具有十分重要的意义。

ITS序列为内源转录间隔区 (internal transcribed spacer region, ITS)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2，即18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28 S rRNA。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，因而在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异明显，可以将菌株鉴定至种、亚种。此外，由于ITS序列片段较小，易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

本实验应用PCR ITS1-ITS2基因分型方法建立无绿藻菌株的ITS基因分型方法，并通过MEGA6.0软件建立系统发育树，比较不同菌株间的基因亲缘性。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌株共5株，其中1号菌株采自中国医学科学院皮肤病医院 (研究所)患者，2号菌株采自山东省皮肤病医院，3号菌株来自华山医院，4、5号菌株采自中山医科大学附属二院。

本实验涉及的测序引物见表1 (上海生工生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

无绿藻菌株分离、纯化及基因组DNA的抽提 将菌株接种于YPD固体培养基，有氧条件下于37℃培养48～72 h。待菌落出现后，分离纯化。取适量菌落悬浮于500 mL蒸馏水中，按照改良版的碱裂解法抽提无绿藻基因组DNA。

SSU rDNA PCR 反应体系总体积为50 μL，包括0.25 μL rTaq聚合酶 (5 U/μL, R001A, Japan, TaKaRa)，5 μL 10×PCR缓冲液，4 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL引物 (50 μmol/L)，及1 μL无绿藻基因组DNA。

30个PCR反应条件为：94℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸2 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶检测，以DNA Marker为相对分子质量标记，电泳结果在紫外灯下观察并照相记录。

表1 本实验涉及的所有PCR引物

ITS1-ITS2 PCR 反应体系总体积为50 μL，包括：1 μL KOD-plus聚合酶 (1 U/μL，Lot.32570h3, Japan, TOYOBO)，5 μL 10×PCR缓冲液，5 μL 2 mmol/L dNTPs，1.5 μL引物 (10 μmol/L)，3 μL MgSO4(25 mmol/L)，2.5 μL 100%二甲亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO)[13]及无绿藻基因组DNA (≤200 ng, ≥1 μL)。

PCR反应条件为：98℃预变性10 min，冰浴5 min后加入1 μL KOD-plus聚合酶。之后进行30个PCR反应循环：98℃变性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 min。PCR产物观察方法同上。

DNA 碱基序列测定 ITS1、ITS2、SSU rDNA区域的PCR扩增产物进行纯化及DNA碱基序列测定 (上海生工生物工程有限公司)。

BLAST序列比对 通过BLAST X在线检索工具将测定的SSU rDNA、ITS1、ITS2区域的DNA碱基序列与Genbank中的数据库进行比对，找出与之相似的序列记录，菌株的鉴定以最高分的菌种决定。

系统发育树绘制 利用MEGA 6.0软件，采用相邻连接法 (Neighbour-joining, NJ)构建系统发育树，并对构建的树进行自检 (Bootstrap)，重复次数设定为1 000次。由于无绿藻SSU rDNA的测序方法相对成熟，当ITS1、ITS2序列建立的系统发育树与之相同时，证明ITS基因分型方法建立成功。

2 结 果

2.1 ITS1-ITS2 PCR

以基因组DNA为模板，通过PCR反应，对ITS1和ITS2区扩增产物纯化、测序后，得到相应大小的片段。电泳结果显示，无绿藻ITS扩增片段的大小呈现一种菌种特异性，P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2区扩增片段均明显大于P.zopfii(见图1)。

2.2 BLAST序列比对

将测序得到的SSU rDNA、ITS1、ITS2序列与Genbank/EMBL/DDBJ数据库中的已知菌株进行BLAST搜索比对。

SSU rDNA序列比对结果显示：1、2号菌株鉴定为P.zopfiiportoricensis(genotype 1)，3号菌株鉴定为P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)，4、5号菌株鉴定为P.wickerhamii。

ITS1、ITS2序列比对与之相同，但由于目前无绿藻ITS基因分型方法尚未建立，缺乏有关P.zopfiiportoricensis的ITS基因序列，因而1、2号菌株暂无比对结果。

但两种方法中，P.zopfiiportoricensis(genotype 1)和P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)菌株的比对可靠性都较高，均大于90%，而P.wickerhamii菌株的比对差异较大[11]，这一点与此前文献的研究结果相符，可能由于P.wickerhamii菌株内部的变异性较大导致。

2.3 系统发育树

在NCBI数据库中，搜索已报道的无绿藻标准菌株的ITS1、ITS2、SSU rDNA序列，进行系统发育树构建 (见图2～4)。

3 讨 论

近年来，随着各种原因导致的免疫缺陷患者人数的增加，无绿藻的感染在全球有上升趋势。截至2012年，全球已报告无绿藻病160例[14]。Chun-Ting Yeh等[2]通过对近3年教学医院的16例无绿藻患者跟踪研究发现，该菌引起免疫低下患者的死亡率高达62.5%，且一般预后较差。此外，中型无绿藻基因2型可导致奶牛患乳腺炎，免疫抑制的小鼠、山羊和猫[13]、犬[15-16]的感染。

由于无绿藻病的临床症状缺乏特异性，加之又缺乏足够的认识和有效的鉴别手段，因而该病的诊断率远低于发病率。目前无绿藻常见的鉴定方法有：形态学及生化反应鉴定、genotype-special PCR、限制性片段长度多态性分析、SSU rDNA测序、LSU rDNA测序，质谱分析。然而，形态学及生化反应鉴定常因为各种因素而产生模棱两可的结果，给无绿藻的鉴定带来困难。genotype-special PCR和RFLP操作较为简便,但只能鉴定P.zopfiigenotype1,P.zopfiigenotype2和P.blashkeae。此外，SSU rDNA测序、LSU rDNA的鉴别力明显低于ITS鉴定。

图1ITS区PCR产物电泳结果：a.ITS1区域PCR产物；b.ITS2区域PCR产物 (1-4.1-4号菌株电泳结果,1-4a.1-4号菌株重复PCR结果,M.5000 bp Marker图2基于ITS1序列的系统发育树图3基于ITS2序列的系统发育树图4基于SSU rDNA序列的系统发育树

Fig.1Electrophoretic patterns of the ITS region PCR products:a.The PCR products of ITS1 region;b.The PCR products of ITS2 region (1-4.electrophoresis results of strains 1-4,1-4a.repeated electrophoresis results of strains 1-4,M.5000 bp Marker)Fig.2Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS1 fragmentsFig.3Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the ITS2 fragmentsFig.4Phylogenetic tree showing the molecular taxonomy of the SSU rDNA fragments

本文利用PCR SSU rDNA、ITS1、ITS2基因分型方法对6株临床无绿藻分离株进行基因分型，共分为3类，其中，1、2号菌株鉴定为P.zopfiiportoricensis(P.zopfiigenotype1)，3号菌株鉴定为P.zopfiihydrocarbonea(genotype 2)，4、5号菌株鉴定为P.wickerhamii。虽然由于数据库中缺乏P.zopfiiportoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定，但ITS区系统发育树中这两株菌株仍被归为P.zopfii中独立的一簇，与SSU rDNA系统发育树相近，证明此分型方法无误。此外，ITS1、ITS2区域的PCR结果显示，扩增片段的大小呈现一种菌种特异性，P.wickerhamii菌株的ITS1及ITS2区扩增片段大于P.zopfii。

由于无绿藻DNA的ITS片段富含GC碱基比，因而在PCR扩增该片段时十分困难。为克服这一问题，我们对此前的研究方法进行了修改[11]，通过在反应体系中添加5% DMSO和在98℃预变性10 min后冰浴5 min，以确保所有的DNA均变性为单链，保证该方法的可靠性和重复性。

本文采用PCR扩增无绿藻临床菌株的ITS1、ITS2目的基因，并根据碱基序列的差异得出了基因分型的结果。由于PCR ITS1、ITS2基因分型法具有准确、简便快捷等特点，在无绿藻多态性分析和流行病学调查中显示出巨大潜力。但由于该方法刚开始应用于研究无绿藻基因型研究，其优、缺点尚待大量流行病学调查数据的积累和更为详尽的分析。

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