大黄酸对非酒精性脂肪肝病模型大鼠干预作用及对血清IL-1β、IL-6的影响

吕媛琳刘晨晨刘 慧张仙土乔 梁包剑锋

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是目前最为常见的一种慢性肝病，其发病率在亚洲地区20年内升高2%[1]。NAFLD以肝实质细胞脂质贮积和脂肪变性为特征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）[2-3]。目前我国非酒精性脂肪肝的发病率约为15%，是肝纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌的重要促进因素[4]。然而NAFLD的发病机制尚不明确，近年研究表明，胰岛素抵抗与炎症反应在NAFLD发生发展中发挥重要作用[5-6]。白细胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）是白细胞介素 1（IL-1）家族的关键调节因子，具有调节炎症反应、肝胰岛素抵抗等作用[7]。白细胞介素 6（interleukin 6，IL-6）作为炎症介质具有多种生物学效应，其浓度高低也与炎症反应密切相关[8]。研究[9]表明，IL-1β、IL-6 可以促进肝脏炎症，诱发脂肪变性。大黄酸是中药大黄的提取物，大黄具有清热解毒、通腑泻热、活血消痈等功效。大黄可通过改善胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），纠正低脂联素血症和脂代谢紊乱等途径，逆转大鼠NAFLD的肝脂肪变性和肝功能异常[10]；可改善肝细胞脂肪变和炎性浸润，减轻线粒体变形和肿胀[11]；采用不同剂量大黄素治疗后，可显著降低血脂和肝脂,改善肝功能[12]。本研究旨在观察大黄酸对NAFLD干预作用及其对血清IL-1β、IL-6的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 雄性SD大鼠40只，动物合格证号：SCXK（沪）2013－0016。体质量（200±20）g，清洁级，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，环境温度18～20℃，湿度50%左右。

1.2 药物及试剂 高脂饲料（货号TP-2003，购自南通特洛菲饲料科技有限公司）；果糖（批号57-48-7，购自湖北赛创生物科技有限公司）；大鼠IL-6 Elisa试剂盒（批号L360014S，美国Bio-Rad）；大鼠IL-1βElisa试剂盒（批号 L474307S，美国 Bio-Rad）；大黄酸（批号NF-20151124，购自西安天丰生物科技有限公司）。

1.3 仪 器 1000mL烧杯：华东医药有限公司；37℃恒温箱：日本日立公司；精密移液器及一次性吸头：美国Bio-Rad；自动化酶免分析仪：郑州安图生物有限公司；离心机KUBOTA6200型：日本KUBOTA公司；日立7180全自动生化分析仪：日本日立公司；精密称量仪：赛多利斯科学有限公司；低速离心机：上海安亭仪器有限公司；自动洗板机：日本KUBOTA公司。

2 实验方法

2.1 分组与造模 40只雄性SD大鼠适应性饲养7天后，按体质量随机分为对照组10只，模型组20只，大黄酸组10只。对照组大鼠喂饲普通中性饲料（脂肪、碳水化合物、蛋白质分别提供13%、65%、22%的能量）+普通饮用水，模型组和大黄酸组大鼠喂饲高脂饲料（脂肪、碳水化合物、蛋白质分别提供45%、33%、22%的能量）+10%果糖水，造模8周。8周后，模型组处死10只HE染色，判断造模是否成功。

2.2 给 药 造模成功后，对照组和模型组大鼠分别给予生理盐水10mg/kg灌胃，每天1次，大黄酸组予大黄酸100mg/kg灌胃，每天1次，连续给药8周，实验期间大鼠自由饮食。实验过程中，由于灌胃操作不规范造成模型组与对照组大鼠死亡各1只。

2.3 观察指标

2.3.1 一般观察 每周对大鼠体质量、肝湿重、进食量及进水量进行测量和记录，观察各组大鼠皮毛光泽度，粪便，以及大鼠的精神状态。

2.3.2 标本处理 16周后，末次给药后禁食12h，3%戊巴比妥纳30mg/kg腹腔内注射麻醉后，无菌条件下解剖大鼠，腹主动脉取新鲜血液10mL，室温静置20min后分离血清，于超低温离心机4℃，3000r/min，15min分离血清，取上清液，置-80℃，备用。

2.3.3 血生化指标及血清IL-1β、IL-6检测 采用PHOMO自动化酶免分析仪检测丙氨酸转氨酶（alaninne aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（Total cholesterol，TG）、甘油三酯（triglycerides，TC）、空腹血糖（glucose，GLU）。采用酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 测定血清白介素 1β（IL-1β）和血清白介素 6（IL-6）。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况 给药前，对照组行为活跃，反应灵敏，食欲好，皮毛光整，无脱毛现象，体质量稳定增长，大便呈颗粒状、色黄、质硬。模型组体型肥胖，反应迟钝，皮毛蓬乱，毛色发黄，欠光泽，后期出现脱毛现象、食欲减退，大便呈颗粒状、色黑、质硬。给药后，大黄酸组体质量下降，皮毛微黄，光泽可，脱毛少见，反应较为灵敏，大便质稀、不成型。

3.2 各组大鼠体质量和肝湿重比较 与对照组比较，模型组大鼠体质量和肝湿重明显增加（P＜0.05）;与模型组比较，大黄酸组大鼠体质量和肝湿重明显降低（P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠体质量及肝湿重比较（g，±s）

表1 各组大鼠体质量及肝湿重比较（g，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

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3.3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6水平升高（P均＜0.05）。与模型组比较，大黄酸组大鼠血清IL-1β、IL-6水平降低（P均＜0.05），见表 2。

表2 各组大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比较（pg/mL，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

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3.4 各组大鼠肝脏病理变化 对照组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，无肝细胞肿胀及脂肪变性，汇管区无炎症细胞浸润；模型组大鼠肝脏细胞呈大泡性脂肪变性为主的混合性脂肪性病变，可见气球样变，汇管区及肝窦出现炎症细胞浸润和偶可见散在的点状坏死；大黄酸组大鼠肝细胞脂肪变程度明显减轻，肝细胞排列紧密，汇管区未见炎症细胞浸润。见图1（插页）。

3.5 各组大鼠血生化指标比较 与对照组比较，模型组大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 明显增加（P＜0.05）;与模型组比较，大黄酸组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、GLU 明显降低（P 均＜0.05），见表 3。

表 3 各组大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比较（±s）

表 3 各组大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

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4 讨论

中医文献中并无脂肪肝病名,但根据其发病特征和临床表现及致病因素应属“肥气”、“胁痛”、“积聚”、“胀满”、“痰浊”、“黄疽”等范畴。其多由饮食膏粱厚味，脾失健运，肝肾阴亏，气机瘀滞，血脉不畅而致。大黄具有泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经的功效，而大黄酸是大黄的主要提取物，属蒽醌类衍生物，具有泻下、抑菌、止血、促进胆汁分泌、降脂、降压和抗肿瘤作用[13]。近年研究[14-15]显示，对脂肪肝、药物性肝损伤等具有保护作用，同时可通过多个靶蛋白发挥抗炎作用。

本研究结果表明，大黄酸组体质量、肝湿重较模型组明显降低，且 ALT、AST、TC、TG、GLU 明显降低（P＜0.05），提示大黄酸可以抑制肝脏脂质沉积。而NAFLD的发病机制目前尚未明确，但胰岛素抵抗（IR）与炎症进展是其重要环节。IL-1β作为IL-1家族的一员，有研究表明在饮食诱导的肥胖模型中，IL-1β的表达可诱导肝脏炎症和肝纤维化[16]。同时IL-1β可促进胰岛β细胞的一氧化氮生成和细胞凋亡，从而选择性破坏胰岛β细胞导致IR，最终促进NAFLD发病[17]。本研究造模后，大鼠血清IL-1β明显升高，而大黄酸干预后其表达明显降低，提示大黄酸可能通过抑制IL-1β的表达从而达到减缓炎症以及胰岛素抵抗治疗脂肪肝。

白介素6（IL-6）是预测或者导致胰岛素抵抗的关键细胞因子[18]。研究[19]表明，IL-6在肥胖患者中的表达比BMI正常患者高30%，提示IL-6可能参与胰岛素抵抗的发生发展。而IL-6可激活Shc/ERK信号通路、mTOR信号通路及PI3K/AKT信号通路，从而促经炎症反应[20]。本研究造模后，大鼠血清IL-6明显升高，大黄酸干预后其表达水平明显降低（P<0.05），提示大黄酸可能通过抑制IL-6的表达从而达到减缓炎症以及胰岛素抵抗治疗脂肪肝。

综上所述，大黄酸可能通过抑制NAFLD大鼠血清IL-1β、IL-6表达，从而改善炎症水平，减少脂质沉积，改善肝脏脂肪变性。

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