越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系建立1)

李艳霞 刘忠玲 刘建明 李桂君

(黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨，150081)

组织培养以其培养周期短，繁殖系数高等优点，成为快速繁殖优良苗木的实用技术，已被广泛应用于农、林业等领域[1-4]。而茎尖培养技术是培育无病毒植株、种质资源保存、育种以及遗传转化等研究的有效手段[5-7]。研究表明，影响植物茎尖培养的有关因子主要有树种和品种[8]、取材及接种时期[9]、外植体的消毒[10]、培养基、激素[11-13]以及培养条件等。

越橘(Vacciniumvitis-idaeaL.)为杜鹃花科越橘属小灌木，是近年来新兴的小浆果树种，目前世界上已有众多的栽培种用于鲜果的生产。科利尔‘Koralle’是从越橘野生群体中选出的栽培种，果实为亮红色，酸甜可口，具有抗氧化、抗衰老、抗溃疡、抗炎和抗瘤等生理功能及药用价值[14]。植株矮化性能好，四季常绿，具有耐瘠薄、耐风、抗旱、耐寒性强等优点，是难得的、十分珍贵的园林绿化植物资源。李亚东等[15]对‘Koralle’光合作用特性进行了研究。吴林等[16]对‘Koralle’的叶片组织细胞结构进行了观察、描述，并测定了叶片、栅栏组织及海绵组织厚度等结构参数。在组织培养过程中，pH值高低都会影响‘Koralle’的腋芽增殖[17]。尽管国内外积累了一些有关‘Koralle’的研究资料，但迄今为止，尚未见其茎尖快繁的研究报道。因此，本研究以‘Koralle’为试验材料，在不同生长期进行取材，对影响茎尖诱导的主要因子进行研究，旨在建立其茎尖离体快繁技术，为获得大量优良苗木提供基础。

1 材料与方法

试验材料为越橘优良品种‘Koralle’，该品种是从白俄罗斯引进，露地栽培于黑龙江省森林植物园基因保存区。

取材及消毒处理：分以下几个时期进行取材试验，即取休眠期枝条于温室内水培催芽，灭菌后接种；取新梢生长初期枝条的顶端新萌发嫩芽，灭菌后接种；取新梢生长中期的顶端嫩枝茎尖，灭菌后接种；取盛花期的枝条顶端茎尖，灭菌后接种；取秋季休眠前的枝条顶端茎尖，灭菌后接种。

取嫩芽放入组培瓶中，滴2滴洗洁精，在自来水下冲洗30 min。在超净工作台上，用75%的乙醇溶液消毒(30、40、50 s)，再用无菌水冲洗2次，转到0.1%升汞(2、4、6 min)中灭菌处理，无菌水冲洗2次，再用2%次氯酸钠溶液处理(1、2、3 min)，无菌水冲洗4次，最后用无菌滤纸吸干表面水分备用。按照正交表L9(34)设计成9种不同的处理。将1 cm长茎尖接种到改良的WPM(分别用708 mg·L-1的Ca(NO3)2·4H2O、202 mg·L-1的KNO3代替WPM培养基中的CaCl2和K2SO4)培养基上，每个处理接种6瓶，每瓶5个茎尖，重复3次。蔗糖20 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH值5.4，培养温度为(23±2)℃，光周期为14 h·d-1，光照强度为2 200 lx，以下组培试验条件均与此相同。接种1周后统计污染率。

培养基、激素对茎尖增殖的影响：分别以MS、WPM、改良的WPM为基本培养基，培养基中分别添加ZT(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和GA3(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)。按照正交表L9(34)设计成9种不同的处理，将茎尖接种到培养基上，30 d后调查其增殖倍数和生长情况。

生根、移栽培养：取继代培养2次的健壮试管苗在温室中炼苗，3～4 d后成簇取出(带有愈伤组织)，用清水冲洗基部，去除培养基。在质量分数为800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min，用消毒的水苔包裹苗，仅露出1/3～1/4顶部，栽到草炭和蛭石基质的营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿，相对湿度控制在85%左右，温度控制在25 ℃，诱导生根，40 d调查生根率。

数据统计分析：按下列方法统计茎尖离体培养污染率、成活率、增殖系数以及生根率，采用SPSS21.0软件进行方差分析和多重比较。

茎尖污染率=(污染茎尖数/接种茎尖数)×100%；

茎尖成活率=(茎尖成活数/接种茎尖数)×100%；

增殖系数=增殖后的不定芽数/接种茎尖数；

生根率=(生根苗数/移栽苗数)×100%。

2 结果与分析

2.1 取材时期对茎尖诱导的影响

由表1可见，从休眠期枝条于温室内水培时期到秋季休眠前期，茎尖污染率呈升高趋势，而茎尖诱导成活率呈下降趋势。休眠期枝条于温室内水培时期与其他时期相比有一定差异，茎尖污染率较低，为7.42%，茎尖诱导成活率较高，为84.01%。新梢生长初期茎尖污染率高于休眠期枝条于温室内水培时期，茎尖诱导成活率与休眠期枝条于温室内水培时期无显著差异，与盛花期、秋季休眠前期差异显著。新梢生长中期茎尖污染率达到50.81%，成活率为45.15%。盛花期和秋季休眠前期茎尖污染率较高，分别为87.90%和92.60%，茎尖诱导成活率较低，分别为10.12%和5.22%。由此可见，不同取材时期茎尖污染率和诱导成活率有很大的差异。

对5次取材结果进行评价得出，污染率由低到高依次为休眠期枝条于温室内水培催芽、新梢生长初期、新梢生长中期、盛花期、秋季休眠前期。在休眠期枝条于室温内水培和新稍生长初期取材，茎尖污染率相对较低，诱导成活率较高，这两个阶段为适宜取材时期。

表1 不同取材时期对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著，同列不同大写字母表示在P<0.01水平下差异极显著。

2.2 消毒剂和消毒时间对茎尖诱导的影响

由表2可见，茎尖污染率和成活率不同处理间均达到差异显著水平。75%乙醇与0.1%升汞、2%次氯酸钠配合使用时，不同处理时间下，茎尖污染率和茎尖诱导成活率差异较大。9个处理中，处理1污染率最高达到76.70%，处理3污染率最低为1.11%。成活率最高的是处理2，为84.15%，成活率最低的为处理3，仅为3.33%。综合考虑，以处理2污染率相对较低，成活率最高，效果最好，即先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞灭菌处理4 min，最后用次氯酸钠灭菌处理2 min，污染率和成活率分别为5.64%和84.15%。

表2不同消毒剂及消毒时间对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响

处理处理时间75%乙醇/s0.1%升汞/min2%次氯酸钠/min污染率/%成活率/%13021(76.70±2.78)a (21.75±7.58)cd23042(5.64±0.33)bc(84.15±4.78)a33063(1.11±0.08)d(3.33±2.95)d44022(45.14±5.47)b(52.42±1.58)b54043(2.45±1.27)cd(21.26±3.47)cd64061(1.55±0.14)d(15.93±3.95)cd75023(4.07±0.97)cd(37.53±2.14)b85041(5.05±1.64)bc(75.82±4.88)a95062(1.91±4.14)d(8.88±2.27)cd

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著。

2.3 培养基、激素组合对茎尖增殖的影响

由表3可见，将茎尖接种到不同处理的培养基上，不同处理间增殖系数、苗高均存在显著、极显著差异。随着ZT质量浓度的升高，增殖系数呈先增大后减小的趋势，说明高质量浓度的ZT对不定芽的分化有抑制作用；苗高随着GA3质量浓度的升高而增高。9个处理中，增殖系数最大的是处理8，为4.85，增殖系数最小的是处理1，为2.06。苗高最高的是处理7，为2.88 cm，生长最慢的是处理1，为1.79 cm。茎尖接种到MS培养基上生长最差，在WPM培养基上生长次之，而在WPM(改良)培养基上生长最好。茎尖在7号培养基上虽然高生长较大，但丛生芽抽长、细弱；茎尖在9号培养基上生长增殖系数、苗高都不如8号培养基上的表现。因此从增殖系数、苗高以及丛生芽生长情况等进行综合评价，8号处理WPM(改良)+1.0 mg·L-1ZT+0.1 mg·L-1GA3为茎尖增殖培养的最佳培养基，增殖系数为4.85，苗高达2.74 cm。

表3 不同培养基、激素组合对越橘‘Koralle’茎尖诱导的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示在P<0.05水平下差异显著，同列不同大写字母表示在P<0.01水平下差异极显著。

2.4 生根与移栽

选取增殖继代培养2次的健壮试管苗，温室中炼苗3～4 d后成簇取出(带有愈伤组织)，在水龙头下冲洗基部，洗净培养基。在质量分数为800 μg·g-1的IBA中浸泡3 min，用消毒的水苔包裹苗，仅露出1/3～1/4顶部，栽到小营养钵(V(草炭)∶V(蛭石)=2∶1组成的基质)中诱导生根，用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿，相对湿度控制在85%左右，温度控制在25 ℃，诱导生根，40 d后生根率达87.14%，平均根长1.25 cm。

3 结论与讨论

适宜的取材时期是降低茎尖污染率、提高茎尖诱导成活率的重要因素[9]。‘Koralle’在休眠期室内水培后萌发出的嫩芽污染最低，这个阶段可显著降低接种的污染率，提高茎尖诱导成活率，为最适宜取材时期。新梢生长中期、盛花期以及秋季休眠前的枝条顶端茎尖生长放缓，由于长时间暴露在室外，污染严重。因此，接种后不易灭菌，导致污染率较高，另外茎尖顶端分生组织分化相对缓慢，以至于诱导成活率较低，应尽量避免这些时期取材。

在茎尖培养过程中，培养基是影响茎尖成活率以及苗木状态的主要因素之一，以往用于蓝莓、红豆越橘、笃斯越橘组培过程中的培养基主要有WPM、WPM(改良)和MS，当然，同一属的不同种以及不同品种对培养基的反应有所不同，使用的培养基不能同一而论[10，18-19]。本研究发现，对于越橘品种‘Koralle’茎尖培养而言，诱导效果由优到劣的培养基排列依次为WPM(改良)、WPM、MS。

植物激素是影响茎尖诱导和增殖的关键因子之一，在组织培养中起重要作用[18]。只有选用合适的激素及质量浓度，才能获得理想的结果。以往对越橘属不同种及品种的研究显示，ZT在茎段、叶片增殖培养过程中起着关键的作用[19-20]，且在0.5～2.0 mg·L-1ZT质量浓度范围内，红豆越橘、笃斯越橘以及不同品种的蓝莓达到最高增殖系数时的所需ZT质量浓度不同。也有研究表明，当ZT质量浓度高于0.8 mg·L-1时，会对蓝莓外植体诱导不定芽产生较大影响，高质量浓度ZT抑制有效芽形成，导致愈伤组织发生严重的玻璃化[21]。本研究中适于越橘品种‘Koralle’增殖培养的ZT质量浓度为1.0 mg·L-1，当ZT质量浓度达到2.0 mg·L-1时，增殖系数降低，但不定芽基部的愈伤组织并未发生玻璃化现象，这可能因品种的基因型而异。

[1] 金彦磊，王秀华，杨永富，等.越橘离体培养的组织学研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2009，21(1)：25-29.

[2] 谢璇，许轲，谢闽新，等.苹果茎尖培养快繁体系的优化[J].植物生理学报，2015，51(12)：2152-2156.

[3] 韩婷婷，孙周平，吴媛媛．矮丛蓝莓茎段再生植株研究[J]．中国农学通报，2010，26(5)：164-168.

[4] 尤燕平，彭诗怡，朱文莹，等.茎尖培养法脱除菊花B病毒的研究[J].南京农业大学学报，2013，36(5):144-148.

[5] 李 松，余坤兴，刘丽敏，等.甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术研究[J].江苏农业科学，2011，39(2)：83-87.

[6] KAVIANI B. Conservation of plant genetic resources by cryopreservation[J].Australian Journal of Crop Science,2011,5(6):778-800.

[7] 王淼淼，马晓月，张学英，等.苹果抗寒矮化砧木71-3-150茎尖培养快繁体系建立[J].西部林业科学，2014，43(6)：44-47.

[8] 浦艳吉，李国怀，姚延兴，等.李茎尖离体培养与植株再生[J].华中农业大学学报，2009，28(2)：214-217.

[9] 高春媛，韩明玉，田玉命，等.影响油桃茎尖初代培养的因素研究[J].西北农业学报，2008，17(2)：174-178.

[10] 田新华，邢亚娟，张建瑛，等.红豆越橘离体培养关键技术研究[J].森林工程，2015，31(2)：57-60.

[11] ELDEEN S A S， SDEED W T, HASSAHLLA I A. Micropropagation of peach rootstocks[J]. Bulletin of Faculty of Agriculture， Univer sity of Cairo，1998，49(4)：549-562.

[12] HAMMATT N. Promotric by phloroglucinol of adventitious root formation in micropropagated shoots of adult wild cherry (PrunusaviumL.)[J]. Acta Hort，1994，14(2)：127-132.

[13] WEI SHU, TIMON B. Preliminary study on the methods of getting virus-free peach plantlets in vitro[J]. Acta Horticulturac，1996，374：191-194.

[14] MICHAL M, JN D, ALENA V, et al. The Effect of intesification factors to total antioxidant activity of highbush blueberry (VacciniumcorymbosumL.) and lingonberry (Vacciniumvitis-idaeaL.)[J]. Potravinarstvo,2015,9(1):585-591.

[15] 李亚东，张治安，吴林，等.红豆越桔光合作用特性的研究[J].园艺学报，1995，23(1)：86-88.

[16] 吴林，刘海广，刘雅娟，等.越橘叶片组织结构及其与抗寒性的关系[J].吉林农业大学学报，2005，27(1)：48-50，54.

[18] 马怀宇，李亚东，刘庆忠，等.高丛越橘离体叶片再生植株研究初报.[J]东北农业大学学报，2004，35(2)：129-134.

[19] 黄文江，刘庆忠，阚显照．高灌蓝莓离体繁殖的研究[J].安徽师范大学学报(自然科学版)，2004，27(3)：314-317.

[20] 郝明明，杜小春，周文婷，等.蓝莓的快速繁殖[J].安徽农业科学，2010，38(2)：11795-11761.

[21] 刘树英，张志东，吴林，等.兔眼越桔芽增生诱导培养基及激素的筛选[J].吉林农业大学学报，2002，24(1)：55-57.