卡氏肺孢子菌的生物学特性简述

冯 洁, 林金杏, 高 诚

(上海实验动物研究中心, 上海 201203)

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii，Pc)是一种人兽共患机会性致病病原体，既往将其列为原生动物门，单孢子虫纲，弓形虫目，称为卡氏肺孢子虫。1980年代后，随着分子水平研究的进展，人们认为它是一种不典型的真菌，将其归为子囊菌纲(Ascomycetes)，并更名为肺孢子菌[1]。该菌可感染多种哺乳动物，常寄居于宿主肺组织，在健康宿主体内并不引发症状，对于免疫低下或缺陷宿主常引起肺孢子菌肺炎。

1 病原特性与分类学进展

20世纪初Chagas和Carinii[2]首次从豚鼠肺组织中发现病原，1912年Delanog’s夫妇从大鼠肺中检出，进一步证实它是一种新的病原体，为纪念Carinii 而将其命名为卡氏肺孢子虫 (Pneumocystis carinii, Pc)。

肺孢子菌在分类学上兼有原虫和真菌二者的特点，长期以来其分类地位一直存在争议。由于其形态和生活史与原虫相似，菌膜结构与疟原虫相似，微管的超微结构与孢子虫类似; 胞膜上富含胆固醇，缺乏真菌胞膜上普遍存在的麦角固醇，广谱抗真菌药物对其无效; 在真菌培养基上不能连续生长，对原虫的药物如戊烷脒、磺胺类药物敏感[3]，因此过去大部分学者倾向于将其归为原虫，归属孢子虫纲(Sporozoa)。

随着现代分子生物学技术的不断发展和应用,人们对肺孢子菌的认识不断深化。Edman等[4]对肺孢子菌16S rRNA基因序列分析表明其与啤酒酵母菌具有很高的相似性, 包囊壁主要成分与酿酒酵母菌同源性高于任何一种已知原虫, 线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚基及细胞色素氧化酶DNA序列与真菌的同源性(60%)超过与原虫的同源性(20%)。将肺孢子菌与酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Canidia albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)及弓形虫(Toxoplasma Gondii)在18S rRNA水平的相似性进行比较，表明其序列与真菌更为相似。肌动蛋白、β-微管蛋白和钙调素是生物进化中最保守的一类蛋白质，将肺孢子菌肌动蛋白基因与其他30多种生物的序列进行比对，表明其与多数真菌相近。肺孢子菌和真菌具有合成蛋白质所必需的延长因子III，而原虫则缺乏这种因子。近年来研究[5-7]表明，其胞膜富含β-1,3-葡聚糖、几丁质等真菌中存在的特异物质，某些超微结构与真菌也相似。上述一系列研究结果从囊壁超微结构、基因序列、蛋白质功能等层面均证实肺孢子菌应归为真菌范畴。1976年Frenkel等[8]报道感染人与鼠的肺孢子菌在形态和免疫原性等方面均有所不同，提议将导致人类肺炎的肺孢子菌命名为耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jeroveci)，此后专业文献[9-12]逐渐沿用这个名称，其真菌分类归属为子囊菌门(Ascomycota)外囊菌亚门(Taphrinomycotina)肺孢子菌纲(Pneumocystidomycetes)肺孢子菌目(Pneumocystidales)肺孢子菌科(Pneumocystidaceae）肺孢子菌属(Pneumocystis)。在2001年召开的机会性原生生物国际研讨会上，科学家们一致通过重新修改命名，以肺孢子菌代替卡氏肺孢子虫成为属，而原先被认为寄生于人体的卡氏肺孢子虫仅寄生于大鼠[13]。

2 流行病学

肺孢子菌呈世界性分布，在多种哺乳类动物，包括人、鼠、兔、犬、猫、猪、羊、灵长类等体内发现过该菌，鼠类的带菌状态非常普遍。不同宿主来源的肺孢子菌异质性较高，染色体核型、基因多态性、免疫原性等差异较大[14,15]。每一种宿主可感染一种或多种不同型的肺孢子菌，不同来源的肺孢子菌形态和生活史较一致，主要有滋养体、包囊前期、包囊三种形态。滋养体形态多变，具有类似原虫伪足结构及其活动方式，发育为包囊前期，经细胞核分裂形成具有8个囊内小体的成熟包囊。包囊呈圆形或卵圆形，表面光滑，直径5～8 μm，囊壁厚100～160 nm[16]。

感染患者和健康带菌者均可为传染源，啮齿类和兔是重要的传播媒介。通常认为肺孢子菌包囊经空气传播进入宿主肺内，附着在肺上皮细胞表面，很少侵入细胞内，呈隐性感染，当宿主免疫力低下时可大量繁殖。但不能通过食物及饮水传播，可经胎盘垂直传播感染胎儿，是否存在血液传播途径目前尚不清楚[17,18]。

动物实验表明[19]，免疫力正常宿主的肺内可带有菌体成为传染源，与病鼠同笼饲养的健康小鼠发生一过性感染，早期 PCR 检查阳性，4 周后可查到包囊，5～6 周后随着获得性免疫反应产生，菌体自动消失，不出现任何临床症状。成熟包囊为感染阶段。陈艳等[20]用Giemsa染色法检查实验小鼠肺孢子菌感染率为2%。Serikawa等[21]取无肺孢子菌感染的409只裸小鼠，放入不同级别的饲养设备饲养, 结果6个月后17.2%的动物呈阳性。兔肺孢子菌自然感染率很高[22]。李华军等[23]于2005年采用染色法和PCR法对6个品系共177只实验动物肺孢子菌隐性感染状况作调查，结果Giemsa法阳性率为6.8%，改良的六亚甲基四胺银(GMS)法阳性率为13.6%，PCR法阳性率高达49.1%。

3 致病性

该菌大多呈隐性感染，机体抵抗力下降时处于潜伏状态的菌体进行大量繁殖，才可能发生显性感染。一般认为[1,24]，机体吸入空气中的肺孢子菌包囊而感染，条件适宜时包囊转为滋养体，后者寄生于肺泡上皮细胞和肺泡间隔内，随肺泡中肺孢子菌的大量繁殖并在肺组织内扩散，纤维连接素在菌体和宿主细胞受体之间起桥梁作用，促使其附着在肺泡表面。随着菌体增殖，肺泡毛细血管通透性增加、肺间质增宽、肺泡上皮细胞脱落，肺泡内出现以滋养体、包囊和炎性细胞为主的渗出物，表面活性物质减少，肺弥散功能降低，导致肺泡-毛细血管血气交换功能障碍，进而引起缺氧出现呼吸衰竭而死亡。近年来关于肺孢子菌感染与宿主免疫应答、免疫调节及影响因素等方面的问题成为该领域的研究热点。滋养体和包囊胞壁上含有多种抗原类物质，如主要表面糖蛋白、P55蛋白、A12蛋白、主要表面糖蛋白相关抗原等，这些蛋白与机体感染肺孢子菌肺炎的过程密切相关。侵袭肺泡时可破坏机体免疫系统，引发宿主产生特异性细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫反应[25-28]。

大鼠、小鼠感染肺孢子菌主要表现为精神沉郁、被毛粗乱、消瘦、发热、咳嗽、呼吸困难等症状。免疫缺陷小鼠、遗传修饰造成免疫功能不全的小鼠易感，呈亚急性或慢性病程，持续数周甚至数月，动物体质量逐渐减轻，呼吸窘迫，衰弱，裸鼠皮肤发绀，年长鼠较年轻鼠严重，呈进行性消耗病特征，最终导致窒息[29]。剖检可见病变多集中在肺脏，表面可见散在米粒大小灰白色结节性病灶，肺泡壁充血、挤压切面有少许粉红色泡沫样液体溢出，肺泡腔内泡沫状渗出物大量肺孢子菌滋养体、包囊及其崩溃物，肺印片可见肺孢子菌，以包囊为主。兔急性肺部感染主要表现为多发、散在的实变灶，多分布于肺野外周。猴感染肺孢子菌后表现为肺水肿、出血、肉样变、间质增宽、肺不张，切面流出红色泡沫样液体，濒死期口吐白色泡沫样物质[16]。

4 实验室诊断

目前，实验室诊断方法包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测3种方法。

4.1 病原学检测

通常取呼吸道样本作染色检查或免疫荧光染色,以显微镜下观察到包囊和滋养体为确诊的金标准。

目前常用的方法包括GMS染色、甲苯胺蓝(TBO)染色和Giemsa染色、瑞氏(Wrights)染色等。GMS染色法对包囊有特异性染色效果，包囊壁染成灰黑色或深褐色，部分囊壁可见括号状结构，但不能识别滋养体和囊内小体。对比度强，菌体易于辨认，简便快捷，应用最为广泛。TBO染色法同样具备操作简便的优点，但内部结构不清晰，染色效果易受温度和时间的影响，现今很少应用此染色法。Giemsa和Wrights法染色后囊壁不着色，可使包囊内小体和滋养体着色，呈淡蓝色，包内可见4～8个深红色子孢子，便于与其他真菌鉴别。近年来建立的荧光染色法和Calcofluor White(CFW)染色法，易于辨认包囊，操作简便可行，适用于快速诊断。

我国实验动物国家标准GB/T 18448.4-2001《实验动物 卡氏肺孢子虫检测方法》推荐实验动物卡氏肺孢子虫检测方法为，对寄生于宿主肺细胞内(或释放于细胞外)的菌体进行固定、Giemsa染色，显微镜下观察到包囊和滋养体判定为阳性。

由于肺孢子菌在不同发育阶段和不同生存环境下的形态也不同，染色镜检直接观察到病原体，特异性强，但对检测人员的染色技术及镜检水平要求较高，且受标本载菌量的影响，因此容易造成漏检[30,31]。

4.2 免疫学检测

酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验检测血清特异性抗体，快速、简便，可用于流行病学调查。另外可采用单克隆抗体直接进行免疫荧光试验或免疫组织化学试验，用于检测组织中的包囊或滋养体，具有较高的特异性和敏感性。但由于其抗原组分复杂，各抗原多肽的抗原性强弱不同，迄今未找到理想的抗原分子，限制了血清学检测方法的开发和应用。

4.3 分子生物学检测

近年来，分子生物学技术已作为传统检测的补充手段，用于流行病学调查和治疗监测。自1990年Wakefield 等[32]首次采用PCR方法从患者肺泡灌洗液中检出肺孢子菌DNA以来，PCR方法因具备特异、敏感和简便等优势在Pc检测中具有广阔的应用前景。检测的标本可为支气管肺泡灌洗液、呼吸道分泌物、外周血单核细胞、血清、环境样本等。引物设计大多为针对18S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、二氢叶酸合成酶基因、线粒体大亚基rRNA基因、主要表面糖蛋白基因等进行设计，较常用的为线粒体大亚基rRNA基因，根据其序列设计的引物特异性和敏感性均很好[33-36]。在传统PCR基础上发展了一些新的PCR检测方法，如毛细管PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等，与常规PCR相比具备更高的灵敏度和特异性。

环介导恒温扩增技术是一种新的核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在恒温水浴(65 ℃左右)反应30～60 min即可完成扩增。杨秋林等[37]选取Pc mtrRNA序列作为LAMP扩增靶序列，设计引物进行扩增，显示具有良好的特异性，敏感性比PCR更高。该方法对仪器设备要求不高，可直接通过肉眼观察反应沉淀即可对结果作出判定，因而具有良好的应用前景和基层推广价值。LAMP操作过程中极易出现气溶胶污染，实际操作时要严加小心。另外，核酸分子杂交技术(包括Southern杂交、斑点杂交、Northern杂交和原位杂交等)因具备较高的敏感性和特异性，也被用作传统染色法的补充手段。

近年来对肺孢子菌开展了大量种内基因分型研究[38-42]，分型遗传标志主要包括：核内rRNA基因(常用的有16S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、26S rRNA基因、内转录间隔区基因等)、线粒体大亚基rRNA基因(mtLSUrRNA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、细胞色素B(CYB)、β-微管蛋白基因等。对于研究肺孢子菌的传播途径、种属特异性、生物学特性，鉴别不同来源和种型的肺孢子菌及指导临床合理用药等方面发挥了重要作用。

综上，目前尚缺乏理想的诊断技术。病原学染色法特异性强，是唯一能直接观察到菌体的方法，但操作繁琐、敏感性低。PCR方法敏感快捷，可作为传统染色法的补充，但受引物设计、反应条件、人员操作等环节的影响，易造成假阳性。因此在规范试剂、环境以及人员操作流程的前提下，PCR方法可用于快速诊断和初步筛查。为提高检测效率，我们认为实际工作中应结合病例的情况，选择合适的检测方法进行多角度综合判定。

5 结语

肺孢子菌作为一种机会性致病因子，广泛分布于自然界，不仅严重危害实验动物健康，对公共卫生也构成重大威胁。当前全球实验动物机构已普遍将其纳入动物质量监控列表。国家标准GB 14922.1-2001《实验动物 寄生虫学等级及监测标准》将其列为清洁级实验大鼠、小鼠必要时检测项目，清洁级兔必须检测的寄生虫项目。该版国家标准是在1994年版GB 14922.1-1994《实验动物微生物学和寄生虫学等级及监测标准》基础上进行修订的，将旧版标准中寄生虫学和微生物学两部分进行拆分，各自形成独立的标准。但新修订的国家标准中该项目仍归属于寄生虫检测项目，仍使用旧名“卡氏肺孢子虫”。病原体的命名和分类归属重新划分具有重要意义，笔者认为目前肺孢子菌已明确属于真菌而非原虫，建议将中文名称改为“卡式肺孢子菌”更为妥当，将其从实验动物寄生虫学标准移至实验动物微生物学标准中的相应位置更为科学，以免造成混乱。实验动物国家标准作为整个行业最基本的纲领和通用要求，应尊重科学，做到与时俱进，动态发展，结合实情适时修订完善，这对于推动整个行业的发展具有积极的引领和促进作用。