食品免疫快速检测新方法及增敏技术研究

2018-03-27 02:55谢春花柳双马宁宁游滢滢张爽宋洋
食品研究与开发 2018年12期
关键词:印迹抗原灵敏度

谢春花,柳双,马宁宁,游滢滢,张爽,宋洋

(天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室,天津300387)

食品安全问题日益复杂,建立灵敏、高效、可现场检测的免疫方法是食品快速检测的发展趋势。近些年来,免疫传感器及其增敏技术、荧光免疫层析技术、可视化凝胶柱免疫检测技术迅速发展,并应用于食品检测。制备可现场检测的可视化便携性小型仪器设备、研发新型标记技术与标记材料、探究新型分析形式是未来食品安全快速检测的重要发展方向。本文综述了新型免疫检测方法以及结合纳米颗粒[1]、亲和素体系[2]、纳米磁性材料[3]、量子点[4]等标记技术达到的增敏效应,采用仿生抗体等新型的标记技术为食品安全快速检测技术的研究提供文献支持。

1 免疫传感器

免疫传感器是根据抗原(抗体)对抗体(抗原)的特异性识别而制成的[5]。它使检测的灵敏度得到了提高,而且使用的检测设备小且方便,测量过程自动化,同时使分析过程简单化,从而减少了分析时间。目前已经开始用免疫传感器来检测食品中的毒素和细菌、毒品和药物的滥用、残留的农药量以及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)光纤等[6]。2013 年Yang Song等[7]利用偶联完全抗原的自主装芯片对水果及果汁中的亚胺硫磷进行了痕量检测,其检测限达到ng/L级,检测时间缩短为30 min,其活化的芯片可对30个样品进行反复测定。其研究结果与同源抗体建立的直接竞争酶联免疫吸附(direc-competition enzyme linked immunosorbent assay,CD-ELISA)方法进行比对,在检测时间、灵敏度、准确度方面均有提高,为表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)在食品中的快速现场检测提供了一定的技术支撑。2014年Yang Lu等[8]研发了一种基于抑制形式的敏感和稳定的SPR免疫传感器,用于检测奶制品和宠物食品中的三聚氰胺(melamine,MEL)。所提出的MEL方法的灵敏度和检测限(limit of detection,LOD)分别为 2.32×10-2μg/mL和1.4×10-3μg/mL,该测定法验证了全奶油牛奶,脱脂奶粉,婴儿配方奶粉,狗食和猫食中的MEL的检测,每种样品的检测灵敏度分别为 2.57×10-2、2.32×10-2、2.51×10-2、2.66×10-2、2.68×10-2μg/kg,远低于 MEL 的最大残留量(maximum residue,MRL)。该方法由于可重复使用性,高灵敏度,短检测时间和简单的样品制备过程等诸多优点,可用于痕量残留检测。

但无论是SPR传感器还是电化学传感,都是基于物理信号输出的分析技术,不能检测到极小的信号的变化,并且容易受到非特异性吸附的信号干扰[9],这就阻碍了其在超灵敏检测中的应用。为了提高检测的灵敏度和准确性,可以采用传感器结合增敏技术的方法,如将免疫传感器与纳米颗粒结合,2013年Xia Sun等[10]采用纳米金粒子(au nanoparticles,AuNPs)和聚苯胺/羧基化多壁碳纳米管-壳聚糖纳米复合物的新型多层膜构建高灵敏度的检测毒死蜱的免疫传感器,用于检测白菜,小菜,生菜和韭菜中的毒死婢,检出限为0.06×10-6mg/mL。2014年Liu等[11]将SPR传感器技术与与抗原特异性抗体结合的Fe3O4磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)分析方法相结合,开发了一种新的方法,用于大豆溴氰菊酯的直接检测。这两种方法的结合使检测的灵敏度提高了4个数量级,最低可测浓度为0.01 ng/mL。2015年中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室的邓绍立[12]及其团队以纳米金为媒介将三聚氰胺(MEL)连接到SPR传感芯片表面,优化最佳抗体用量和再生条件,测试芯片稳定性和方法的准确性。在无污染的牛乳中添加系列质量浓度的MEL,采用竞争抑制法建立抑制标准曲线,并对实际样品进行检测,该方法检测限为3.24 ng/mL,远低于国际食品法典委员会和国家有关部门规定的残留量,同时相比于之前的实验结果,检测限更低。该方法在30 min内完成样品的前处理和检测,适合牛乳生产现场快速定量检测,而且芯片制备方法简单、造价极其低廉、无毒无污染、便于推广、再生性能好、可多次重复使用。

同时免疫传感器还可以与亲和素相结合。生物素与亲和素是自然界中亲和力最强的化合物,其亲和力可以达到1014。2013年南开大学信息技术科学学院刘儒平等[13]基于SPR传感器的基础上,通过亲和素固定生物素标记的二抗,一抗与二抗反应固定于传感器CM5芯片上,从而达到了对低浓度大肠杆菌ATCC25922的快速检测,同时该方法通过一抗和二抗的质量扩增效应和生物素-亲和素的多级放大效应,提高了SPR传感器灵敏度,检测下限为1.5×102CFU/mL,检测时间约为35 min。利用生物素-亲和素体系与抗原抗体的偶联达到信号放大的目的,可有效降低非特异性吸附,提高检测的信号,从而可缩短检测时间并使得检测限和灵敏度得到提高。

2 荧光免疫层析

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相,荧光标记抗体或抗原固定于连接垫,通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动[14-17]。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等),通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法,即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合,当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等),待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后,由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以,一般用竞争免疫层析法来检测具有单一抗原表位的小分子物质[18]。2015年张金艳等[19]利用偶联反应物CdTe-抗克伦特罗抗体(CdTe-Anti clenbuterol Polyclonal,CdTe-Anti CLE pAb)作为荧光标记物,组装出一种用于检测克伦特罗的荧光免疫试纸条,最低检测限达0.5 μg/L(目前市场上广泛引用的胶体金试纸条的检出限为1.0 μg/L~3.0 μg/L),为瘦肉精市场监督提供了一个新的荧光试纸条。使用量子点的优势在于量子点的激发光谱宽、发射光谱窄、荧光强度高、稳定性强,生物兼容性好等特点,在偶联剂的作用下,可以与抗体相连接,形成特异性的偶合物,特别是用这种偶合物作为标记物,可以显著降低检测方法的检测限。同年李静宇等[20]采用荧光胶乳微粒为标记物制备了克隆特罗荧光免疫层析试纸条。最佳制备条件:抗原包被浓度2.00 mg/mL,膜干燥时间5 d,混匀反应时间1 min,反应温度25℃,层析时间15 min。评价结果显示,试纸条检测限可达0.35 μg/L。该方法在食品安全检测应用方面的研究已有报道,且其灵敏度是胶体金法的5倍~10倍。

2017年丁乔棋等[21]以羧基化CdTe/ZnSe量子点荧光微球为标记物,通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(1-Ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-Hydroxysuccinimide,EDC/NHS) 活化法将氯霉素(chloramphenicol,CAP)单克隆抗体与量子点荧光微球偶联制备荧光探针。氯霉素全抗原(chloramphenicol-succinic anhydride-albumin from bovine serum,CAP-HS-BSA) 及羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维素膜,组装成新型氯霉素量子点荧光微球免疫层析试纸条,建立了快速、定量检测牛奶中CAP的方法。开发的量子点荧光微球试纸条可在15 min内完成牛奶样品中CAP的定量检测,线性范围为 0.10 μg/L~100.00 μg/L,检出限为 0.1 μg/L。该试纸条在两周内的稳定性良好。2017年张世伟等[22]于抗体亲和位点保护标记方法制备抗河鲀毒素抗体偶联荧光微球,方法简单稳定,所有结合分离步骤均在亲和柱中完成,避免了亲和位点被破坏而且荧光信号更强,将检测灵敏度提高至原来的8倍左右。研究了荧光抗体稀释液配方,使荧光标记抗体一体式组装在测试卡上6个月荧光衰减小于30%,从而使该技术能够以测试卡的形式商品化应用,所建立的河鲀毒素检测方法灵敏度为18.4 ng/mL,检测河鲀样本的最低检出限为10.00 μg/kg。该方法适用于热加工样品的检测,该检测过程非常迅速,所用时间仅15 min,且不需要用大型设备,为河鲀餐前速测提供了一定技术手段。

3 凝胶柱免疫可视化检测

现在的检测技术已经越来越多,但快速、可视化、普遍、实用的技术更受欢迎,而凝胶柱免疫可视化检测技术就可以达到这种要求。2012年Meng Yuan等[23]开发了一种基于凝胶的非仪器性免疫亲和试验,用于快速筛查氯霉素(CAP)。免疫亲和力测试柱(immunoaffinity test column,IATC)由含有抗CAP抗体偶联凝胶的测试层和含有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)抗体偶联凝胶的对照层组成。基于直接竞争性免疫反应和辣根过氧化物酶酶促反应,可以直观地评估测试结果。颜色的变化可代表检测结果。结果表明,牛奶中氯霉素最低检测量为1 μg/L、奶粉中的氯霉素最低检测量为6 μg/L、蜂蜜中的氯霉素最低检测量为4 μg/L、鱼和虾中的氯霉素最低检测量均为2 μg/L。该测定方法几乎不需要样品预处理,整个过程在10 min内即可完成。基于凝胶的免疫亲和测试是一种简单、快速且有前途的检测方法,可用于食品样品中CAP残留物的可视化快速检测且无需仪器设备。

2016年生威等[24]采用活化酯法制备恩诺沙星与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联物作为酶标抗原。整个检测在一个标准的1 mL固相萃取柱(solid phase extraction column,SPE)中进行,柱中包含两层:一个结合了恩诺沙星特异性抗体的凝胶检测层和一个结合了HRP抗体的凝胶质控层。将样品提取液与酶标抗原预混合后加入到检测柱中,基于抗原抗体的竞争结合反应和辣根过氧化物酶的酶促反应,根据检测柱的检测层颜色的深浅和有无来定性半定量检测恩诺沙星的含量。该凝胶检测柱的检测限为5 μg/L,整个检测过程可以在10 min内完成,猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉和牛奶等动物源性食品中恩诺沙星检测限为100 μg/kg。该方法具有准确、灵敏、特异性好、操作简便快速、成本低等优势,适合动物源性食品中恩诺沙星残留的快速筛查。而在2017年生威等[25]又采用类似的方法半定量检测呋喃它酮代谢物的含量。整个检测过程可以在10 min内完成,该凝胶检测柱的检测限为20 μg/L;牛肉、鲷鱼、鸡肉、虾肉、猪肉、鱿鱼、鸡肝和黄花鱼等动物源性食品中呋喃它酮代谢物的检测限为3 μg/kg。同年齐玉杰等[26]采用活化酯法制备三聚氰胺酶标抗原,将三聚氰胺抗体、过氧化物酶抗体分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备相应的抗体胶作为检测层和质控层,方法检测限为200 μg/L。对牛奶、奶粉、发酵乳等乳制品进行检测,测得所检样品中三聚氰胺的检测限为1 mg/kg。该检测方法操作简便,结果易判断,整个检测过程约15 min,是三聚氰胺现场快速检测的有效手段。

4 仿生免疫检测

免疫检测方法多数具有稳定性不好的缺陷,而仿生抗体便可以解决这个难题。仿生免疫检测是指分子印迹聚合物(molecular imprinting polymer,MIP)具有的可以特异性识别待测物质的位点,与待测物质特异性结合,类似于抗原抗体识别反应。利用仿生免疫方法进行分析的方法称为仿生免疫分析。仿生抗体可以与不同的检测方法结合,从而达到不同的效果,目前国内外已经有很多相关的研究。

4.1 仿生抗体用于酶联免疫吸附检测

2015年ChenShi等[27]描述了一种新的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法,其中亲水印迹膜作为用于测定多农药残留物的仿生抗体。使用4-(二甲氧基硫代硫代氨基)丁酸作为模板分子,直接在96孔板的表面上合成可选择性识别敌百虫和乙酰甲胺磷的印迹膜。该膜具有抗体样识别能力,快速吸附-解吸动力学和良好的稳定性。该方法适用于芦笋和黄瓜样品中敌百虫和乙酰甲胺磷的测定,其中敌百虫的回收率为72.1%~92.0%,乙酰甲胺磷为70.0%~85.0%。该测得所取韭葱样品中的乙酰甲胺磷水平为(2.15±0.08)mg/kg,高于日本肯定列表系统的最大残留限量(MRLs,0.1 μg/mL)。因此,应该加大力度控制农产品中的农药残留。与传统的酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和色谱方法相比,该方法的操作程序更简单,并且不需要大量的仪器。由于MIP的高选择性和不需要SPE等预处理程序,因此仿生酶联免疫吸附测定法(bionic enzyme-linked immunosorbent assay,BELISA)方法的基质效应很小。此外,BELISA方法可以选择性识别和检测敌百虫和乙酰甲胺磷,更重要的是,该方法可以重复使用超过10次并保持灵敏度。2017年Lu Li等[28]利用分子印迹聚合物(MIP)膜作为仿生抗体,开发了具有高度选择性和高灵敏度的ELISA,可用于检测孔雀石绿(MalachiteGreen oxalate,MG)。多巴胺的自聚合MIP膜附着在96孔微板的表面上,在水溶液中可对MG特殊识别。通过该方法建立的直接竞争ELISA,灵敏度达到了10.31 μg/L,其检出限为0.30 μg/L。通过该法对水、鱼样品进行检测,加标回收率为87.8%~94.6%,相对标准偏差小于3.6%。结果说明该方法可用于样品的快速,准确的检测。2018年Zhang等[29]开发了基于具有特定识别的纸上分子印迹聚合物(MIPs-paper)的BELISA。BELISA的作用原理是利用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(3-(methacryloxy)propyltrimethoxysilane,γ -MAPS)水解作用对纸张表面进行改性,并通过共聚将其固定在γ-MAPS改性纸上以构建人工抗体。通过一系列实验和验证,成功获得了MIPs,并建立了一种基于MIPspaper的BELISA法,该法可简单有效的检测西维因且具有成本低、准备简单、准备时间短、重复性好、经济实惠等优点。该法的灵敏度和检测限分别为0.116 mg/L和0.007 mg/L,而中国国家食品安全标准(2014)宣布食品中西维因的最高残留限量为1 mg/kg,该方法的灵敏度和检测限远低于国家标准。基于MIPs-paper分析方法的高选择性,该方法成功应用于分析水稻和大白菜样品中的西维因,并测得其添加回收率在67.2%~119%之间。该方法不仅可以为食品安全领域快速检测提供技术支持,还可为西维因快速高效检测提供便利工具。

2012年任蕾[30]以苯磺隆为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,采用本体聚合法在96孔酶标板上直接合成了对苯磺隆具有高选择识别能力的分子印迹聚合物膜,苯磺隆分子印迹聚合物膜具有较高的特异性和较快的传质速度。在相同的实验条件下,印迹聚合物膜的饱和吸附容量最高可达到非印迹聚合物膜饱和吸附容量的1.28倍。在最适条件下,所建立仿生酶联免疫方法的灵敏度即IC50为 15.77 μg/L,最低检出限即 IC15为 0.01 μg/L,远低于欧盟规定的苯磺隆的最大残留限量0.05 mg/L。2015年李鸿英[31]采用本体聚合方法以3,5-二羟基-2-萘甲酸为假模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,在酶标板孔表面直接紫外引发合成了对桔霉素分子印迹聚合物膜,成功将分子印迹技术应用于免疫分析中,建立了一种食品中桔霉素分子印迹仿生酶联免疫吸附法。印迹膜饱和吸附容量达到1.07 μg/well,明显高于非印迹聚合物膜(0.213 μg/well)。此方法被成功地应用于米饭,玉米,米醋三种样品中的桔霉素的分析检测,测得米饭的最低检出限为 40 μg/kg、玉米的最低检出限为 60 μg/kg、米醋的最低检出限为20 μg/kg,3个添加浓度下的回收率分别达到73.2%~89.9%,64.3%~86.2%和82.3%~92.8%。但该法也存在一定的局限性:如可供选择的亲水性功能单体比较单一,从而对生物抗体的选择性和专一性造成了影响。2017年吕春晖等[32]在聚苯乙烯酶标板表面直接合成对恩诺沙星具有特异性识别吸附能力的分子印迹聚合物,将其作为仿生抗体代替生物抗体,建立直接竞争仿生酶联免疫分析法(ELISA)进行恩诺沙星的检测。最适条件下仿生酶联免疫方法的最低检出限(IC15) 为 0.80 μg/L,灵敏度(IC50)为65.93 μg/L。该方法对鸡肉组织和猪尿两种样品的添加回收实验中(鸡肉加标量分别为 2.5、15、75 μg/kg;猪尿加标量分别为 5、30、150 μg/kg),有较高的回收率(鸡肉:97.30%~103.56%;猪尿:94.48%~96.53%)。该仿生ELISA法准确度、精密度及特异性均较高,步骤简单,与传统ELISA方法相比省时经济,可以应用于实际样品中恩诺沙星残留的快速检测。

4.2 仿生抗体与SPR结合

2013年Gui-Hong Yao等[33]将表面等离子体共振(SPR)光谱整合并将其与表面分子印迹识别系统结合,同时利用磁性分子印迹聚合物即纳米粒子放大SPR的响应值,从而提高了检测的灵敏度。磁性分子印迹聚合物是在模板毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)的基础上弱碱性水溶液中Fe3O4纳米粒子(Fe3O4nanoparticles,Fe3O4NPs)表面上的多巴胺自聚合而设计的。通过傅立叶变换红外光谱,紫外可见吸收光谱和透射电子显微镜表征印迹的Fe3O4@聚多巴胺(polydopamine,PDA)纳米粒子。在 0.001 μmol/L~10 μmol/L 的范围内,生物传感器的SPR角度变化与毒死蜱浓度呈良好的线性关系,检测限为0.76 nmol/L。因此,通过使用印迹Fe3O4@PDA纳米粒子作为放大器可以显着提高灵敏度,同时,印迹Fe3O4@PDA纳米粒子对毒死蜱的识别能力优于其他杀虫剂。设计的生物传感器具有卓越的灵敏度和选择性以及高度的稳定性,并对苹果样品进行了测定,获得了93%~104%的回收率,说明该方法在实际样品中使用具有良好的准确性和实用性。2015年Mehmet等[34]通过在金片表面制备烯丙基硫醇的自组装单层,形成用于选择性测定牛奶中的催产素的分子印迹表面等离子体共振传感器,该方法新颖且灵敏的。然后,在烯丙基硫醇修饰的芯片上进行催产素(Oxytocin,OXT)印迹的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酰胺基谷氨酸)纳米膜。通过傅里叶变换红外光谱、原子力显微镜、椭偏仪、扫描电子显微镜和接触角测量对未改性和改性表面进行表征。基于表面等离子体共振的分子印迹传感器也成功应用于牛奶样品中催产素的测定,检测极限为0.003 0 ng/mL。催产素印迹表面等离子体共振传感器良好的重复性为以后传感器的研究提供了参考。2018年Onac等[35]利用碳纳米管包裹聚合物膜开发了用于测定三聚氰胺的表面等离子体共振的方法。它可以通过分子印迹聚合物膜测定三聚氰胺,并具有操作简单、高选择性、高灵敏度、低成本的优点。为此,开发了用于测定奶样中三聚氰胺的分子印迹传感器。该研究分3个阶段完成。在第一阶段,三聚氰胺由新一代碳纳米管膜转移,通过添加纳米材料而得到改善。在第二阶段,生产印刷的生物传感器芯片用于测定三聚氰胺。在最后阶段,制备的生物传感器芯片被用于表面等离子体共振系统中三聚氰胺的测定和动力学分析。在10 d结束时,牛奶样品中的三聚氰胺以82.87%的效率运输。通过在SPR传感器芯片的表面上制备三聚氰胺印刷聚合物纳米薄膜层,以高度敏感,选择性和简单的方式实现了三聚氰胺的测定。通过使用新一代碳纳米管膜(碳纳米管聚合物(carbon nanotube polymer,CNT/PIM),开发了纳米增强膜,其包括高渗透性和抗污染的机械强度,并且实现膜的活性层被最小化。制备的生物传感器具有与传统分析技术相比有许多特点,如快速实时识别,低成本,便携性,简单处理和样品制备的简易性。

5 食品检测增敏技术的发展前景

食品安全作为重要的公共卫生问题,受到普遍关注。食品中残留或存在的有害物质与人类的健康息息相关,因此高效、简单、方便、廉价、普遍性高、灵敏度高的检测方法成为检测食品安全的重要目标,而新型标记技术与标记材料、新型分析形式是食品检测新的发展方向。对国内外可视化、可现场检测、普遍性的食品安全检测方法以及与之结合的增敏技术作出综述,希望为我国食品质量安全的快速、高效检测技术的提高提供理论支持。

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