miR-1过表达对鼻咽癌细胞的调控作用及其机制

章凯，王建洪，罗小邹

(宜宾市第一人民医院，四川宜宾644000)

鼻咽癌是发生在鼻咽腔顶部以及侧壁的恶性肿瘤，在我国广东、广西、福建和湖南等省份发病率较高。鼻咽癌的发病年龄大多为40～60岁，男性多于女性。目前认为，鼻咽癌的发生、发展是多重基因事件参与的复杂过程，其发病机制与EB病毒感染、环境、饮食和遗传因素、多种癌基因与抑癌基因的相互作用密切相关[1]。鼻咽癌的治疗以放疗为主，但由于鼻咽癌易局部复发和远处转移，治疗效果不佳。随着分子生物学的发展，已发现部分生物学标志物对恶性肿瘤诊断及预后预测具有重要作用。因此，在分子层面探寻鼻咽癌的发病机制及相关生物学标志物，对鼻咽癌的风险评估和治疗策略制订具有重要意义[2]。微小RNA(miRNA)是一类非编码单链小分子RNA，通过多种信号通路调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、黏附和血管生成，在肿瘤的发生、发展过程中发挥促癌或抑癌作用[3]。Chen等[4]研究发现，miR-155、miR-138、miR-25等11种miRNA在鼻咽癌组织中表达升高，miR-200a、miR-143、miR-204等24种miRNA表达降低。近年研究显示，miR-1亦参与多种肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡，在多种肿瘤组织中表达下调，可作为抑癌基因发挥作用[5,6]。我们前期研究发现，miR-1在鼻咽癌患者血清中表达降低，但其作用机制尚不明确。2015年5～12月，本研究观察了miR-1对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌CNE2细胞系来自宜宾市第一人民医院实验中心，TRIzol购于美国Invitrogen公司，流式细胞仪购于杭州艾森生物有限公司，逆转录试剂盒购于日本TOYOBO公司，恒温水浴箱购自巴基斯坦Precitherm PFV公司，PCR仪购于美国Gene Technologies公司，电泳仪购于北京市六一仪器厂，凝胶成像系统购自美国BioSpectrum AC公司，RNA/DNA检测仪购自美国Gene Quant公司。

1.2 细胞培养及分组转染 将CNE2细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞融合70%～80%时，消化传代。随机将细胞分为对照组与转染组，按照转染试剂使用说明，分别转染negative control miRNA mimics、miR-1 mimics。

1.3 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。转染24 h收集细胞，接种于96孔板，每孔加CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶标仪于480 nm波长处检测各孔的吸光度(OD)值。以OD480值代表细胞增殖能力。

1.4 细胞周期检测 采用流式细胞术。转染48 h收集细胞，生理盐水冲洗2遍，70%乙醇固定1 h。4 ℃碘化丙啶避光染色30 min，铜网过滤，流式细胞仪检测各周期细胞比例。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。转染48 h收集细胞，经胰酶消化、吹打，制成单细胞悬液。将单细胞悬液接种于12孔板，恒温培养24 h。待细胞长成单层，弃培养液，于每孔中央划出划痕，洗去死亡细胞，显微镜下拍照。利用软件测量24 h细胞迁移距离。

1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验。转染12 h收集细胞，用无血清的RPMI1640培养液重悬细胞，接种于Transwell小室内，外槽加入含5%血清的培养基。培养12 h，蘸去上层细胞，DAPI染核。荧光显微镜下计数迁移细胞数。

1.7 c-met mRNA表达检测 转染48 h收集细胞，加入TRIzol 1 mL，充分混匀后移至EP管中。加入氯仿200 μL，剧烈振荡15 s。室温静置5 min，充分裂解沉淀，于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，加入异丙醇500 μL，反复混匀，- 20 ℃静置30 min。于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入75%乙醇，振荡摇匀，于4 ℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清。加入无水乙醇1 mL，小心弃上清，超净工作台干燥10 min。将沉淀溶于30 μL DEPC水中，抽吸数次。加样混匀3～5 s，RNA热变性(65 ℃孵育5 min，冰上1 min)，加样混匀(20 μL)。逆转录反应条件：42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。瞬间离心后将cDNA置于于- 20 ℃冰箱保存备用。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。c-Met上游引物5′-TCTTGGGACATCAGAGGGTC-3′，下游引物5′-TGACTGCAGGACTGGAAATG-3′;β-actin上游引物5′-CCGAATTCATCATGTTTGAGACCT-TCAA-3′,下游引物5′-CCGGATCCATCTTGCTCGAA-GTCCA-3′。加样(cDNA 2 μL，蒸馏水7 μL，Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL)混匀，进入PCR扩增程序(95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min)，共35个循环，瞬间离心后得到PCR产物，制胶电泳得到目的条带后再进行分析。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.8 c-met蛋白表达检测 采用Western blotting法。转染48 h收集细胞，采用含50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆酸钠、0.1% SDS和蛋白酶抑制剂及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液提取细胞总蛋白。通过SDS-PAGE分离蛋白，所有操作按说明书进行。以β-actin为内参照，通过检测目标条带目标区域中经背景修正之后所有像素积分密度值的总和，计算目标条带吸光度值与内参照条带吸光度值的比值作为c-met蛋白相对表达量。

1.9 miR-1靶基因预测与验证 采用荧光素酶实验。构建c-met野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-WT，并以pMIR-WT质粒为模板，利用PCR搭桥法构建其潜在结合位点突变型报告基因质粒pMIR-Mut。将miR-1 mimics、negative control miRNA mimics内参海肾荧光素酶以及pMIR-WT和pMIR-Mut报告基因质粒共转染CNE2细胞。在细胞培养箱中培养36 h，用passive lysis buffer裂解细胞并分析双荧光素酶活性。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 转染组细胞增殖能为为0.65±0.11，对照组为1.00±0.05，两组比较P<0.01。

2.2 两组细胞周期变化 转染组G0/G1期细胞比例为(55.2±4.1)%，G2期细胞比例为(19.5±2.3)%，S期细胞比例为(22.6±2.8)%；对照组G0/G1期细胞比例为(43.1±5.0)%，G2期细胞比例为(23.5±3.0)%，S期细胞比例为(33.4±4.2)%。与对照组比较，转染组G0/G1期细胞比例升高(P<0.05)，S期细胞比例降低(P<0.05)，G2期细胞比例变化不明显(P>0.05)。

2.3 两组细胞迁移和侵袭能力比较 转染组、对照组细胞迁移距离分别为(175.5±22.4)、(225.4±26.3)mm，侵袭细胞数分别为(36.2±4.1)、(58.5±6.7)个/视野。转染组细胞迁移距离短于对照组，侵袭细胞数少于对照组(P均<0.05)。

2.4 两组c-met表达比较 转染组、对照组c-met mRNA相对表达量分别为0.44±0.06和1.00±0.01，c-met蛋白相对表达量分别为0.17±0.06、0.65±0.11。与对照组比较，转染组c-met mRNA及蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。

2.5 miR-1的靶基因预测及验证 用miRNA靶点数据库targetscan对miR-1的靶基因进行预测，结果显示c-met可作为其潜在靶基因。双荧光素酶检测结果显示，miR-1 mimics可明显抑制pMIR-WT质粒荧光素酶活性，而对pMIR-Mut质粒荧光素酶活性无明显影响。

3 讨论

鼻咽癌是一种鼻咽部恶性肿瘤，近年来随着诊疗技术的进步，以放疗为主的综合治疗明显改善了鼻咽癌的局部控制率，但由于其发病部位隐蔽，易发生早期远处转移及局部转移，严重影响其治疗效果[7]。因此，深入探究鼻咽癌病理过程的分子机制，寻找新的诊断及治疗生物标记物，对于改善预后具有重要意义。miRNA是一类长18～24个核苷酸的单链非编码小分子RNA，通过与靶基因的3′-UTR不完全互补配对,在转录后水平调控蛋白表达，可参与调控细胞生长、增殖、发育、分化及凋亡等生命活动。近年研究发现，miRNA在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。特异性miRNA的表达异常能影响肿瘤的增殖、侵袭和转移，发挥癌基因或抑癌基因作用。越来越多研究发现，鼻咽癌细胞或组织中存在很多差异表达的miRNA。有研究显示，miR-144通过抑制PTEN促进鼻咽癌的发生及发展。miR-200可抑制ZEB2和CTNNB1的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭[8,9]。研究表明，miR-1在肺癌、肝癌、前列腺癌等组织中均表达较低，扮演抑癌基因的角色[10]。miR-1可通过抑制LIM和SH3蛋白质的表达来抑制前列腺癌细胞的运动能力。Yu等[11]发现，miR-1可抑制非小细胞肺癌A594细胞的增殖和侵袭能力。Xu等[12]研究显示，miR-1可对LIM蛋白和LASP-1靶向调控，miR-1过表达在结直肠癌中可抑制上皮间质转化和远处转移。但miR-1对鼻咽癌生物学行为的影响鲜有报道。

前期研究发现，miR-1在鼻咽癌患者血清中的表达低于健康人群，提示miR-1低表达可能与鼻咽癌的发生、发展有关。本研究将miR-1 mimics转染入CNE2细胞使细胞内miR-1过表达，结果发现CNE2细胞增殖能力被抑制。流式细胞术检测结果显示，miR-1过表达可将CNE2细胞阻滞于G0/G1期并抑制S期细胞聚集。细胞划痕实验和Transwell实验结果均显示，miR-1能够抑制CNE2细胞的迁移和侵袭。以上结果表明，miR-1在鼻咽癌的病理过程中发挥抑癌基因作用。

c-Met是HGF的特异性膜表面受体，定位于人7号染色体长臂，属于酪氨酸激酶受体类。c-Met在正常组织中低表达或不表达，但在胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等组织中异常表达[13]。Herynk等[14]发现，结肠癌组织中HGF与c-Met mRNA 及蛋白表达明显高于癌旁正常组织。Rolle等[15]发现，c-Met、p-Met及HGF在小细胞肺癌和非小细胞肺癌组织中均高表达。c-Met高表达可促进肿瘤细胞的增殖、迁移，细胞外基质浸润，并诱导肿瘤新血管的生成。大量研究显示，抑制c-Met表达能够抑制肿瘤形成和生长。HGF与c-Met结合构成HGF/c-Met信号通路，在肿瘤的生长、侵袭、转移及肿瘤新生血管形成过程中具有重要作用。HGF与c-Met的胞外区特异性结合后，c-Met胞内的酪氨酸残基发生自身磷酸化并激活蛋白激酶结构域中的酪氨酸激酶活性，从而引发c-Met羧基末端的自身磷酸化。激活的c-Met可使调控细胞生长、黏附与运动等不同生物学效应的底物蛋白快速磷酸化，继而激活多种信号通路，调控细胞的增殖、分化、迁移及凋亡。Li等[16]研究发现，鼻咽癌肿瘤组织c-Met表达与淋巴结转移呈正相关关系，提示其可增强肿瘤细胞的转移能力。有研究还发现，c-Met在鼻咽癌组织及癌旁正常黏膜组织高表达，而在健康人体鼻咽黏膜组织中低表达，提示c-Met高表达对鼻咽癌的诊断及预后具有重要意义[17～19]。为进一步研究miR-1在鼻咽癌中的抑癌作用机制，本研究通过miRNA靶基因数据库进行筛选，结果显示c-Met是miR-1的潜在靶基因，双荧光素酶检测结果验证了miR-1能够与c-Met的3′-UTR特异性结合，抑制c-Met mRNA和蛋白表达，结果表明miR-1可能通过抑制原癌基因c-Met表达，从而在鼻咽癌中发挥抑制作用[20，21]。

综上所述，miR-1通过结合其靶基因c-Met的3′-UTR，从而抑制c-Met mRNA和蛋白表达，阻滞鼻咽癌细胞于G0/G1期并抑制其S期聚集，继而抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，发挥抑癌基因作用。由此推测，miR-1有可能成为鼻咽癌诊治及预后预测的新靶点。