曾江华,蒋仕秋,刘海荣,刘月明△
1.成都医学院第一附属医院 烧伤科(成都610500);2.成都医学院第一附属医院 科研中心(成都 610500)
炎症反应是机体防御反应的重要部分,可提高机体病原体清除能力、促进组织修复,但过度的炎症反应又可加重组织损伤。同时炎症也是众多疾病发生、发展的基本病理过程,在疾病始动过程中扮演重要角色。例如2型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、非酒精性脂肪肝等慢性疾病的发病本质是巨噬细胞介导的慢性低度炎症[1];炎症失衡是造成全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的重要原因之一,早期预测和有效干预体内抗炎/促炎细胞因子平衡,是避免SIRS进一步向多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)发展的关键[2]。因此,有效干预、调控体内炎症平衡对疾病的预防及治疗具有重要意义。
MTs是以分子量较小(约6~7 KDa),富含半胱氨酸为特征的一类细胞内应激蛋白,普遍存在于生物界,具有高度可诱导特性及独特的金属硫四面络合结构。哺乳动物MT主要有MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ、MT-Ⅳ4种亚型。其主要亚型MT-Ⅰ/Ⅱ在各种组织中均有表达,以肝、肾含量最丰富,是具有高度同源性的异构体,也是目前研究MT的主要形式。近年研究发现,MT-Ⅰ/Ⅱ在调节炎症反应方面具有显著作用。Inoue等[3]认为MT-Ⅰ/Ⅱ是一种抗炎介质。本文通过对MT-Ⅰ/Ⅱ的分子结构、基因表达调节及参与炎症反应的可能机制进行综述,旨在为临床炎症治疗提供新思路。
哺乳动物MT-Ⅰ/Ⅱ在结构进化中相对保守,是由61~62个氨基酸残基序列组成的单链蛋白质,不含组氨酸及芳香族氨基酸,约含30%的半胱氨酸,且半胱氨酸结合形式相对稳定,主要有3种形式:Cys-X-Cys、Cys-X-Cys-Cys及Cys-X-X-Cys,X代表半胱氨酸以外的氨基酸[4]。MT-Ⅰ/Ⅱ在没有与金属离子结合时称为硫蛋白,由于氨基质子的高频振荡处于无序状态,极不稳定,一旦与金属离子结合就会折叠形成稳定的空间结构[5],具有较强的耐热性,可对抗多种酶的降解。近年来人们通过核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)和X射线晶体衍射法(X-ray crystallographic methods)测定发现,MT-Ⅰ/Ⅱ分子不含α螺旋和β折叠。空间结构为中心由硫醇相连的两个大小相当近似球形的α结构域、β结构域组成,形似哑铃状[6]。α结构域与β结构域分别含有11个、9个半胱氨酸残基。前者可结合4个二价金属离子或者6个一价金属离子;后者可结合3个二价金属离子或者6个一价金属离子[7]。且MT-Ⅰ/Ⅱ带负电荷,等电点为pH 3.9~4.6,易与金属离子相结合形成稳定的四面体结构[8]。此构象极稳定,决定了MT-Ⅰ/Ⅱ具有较强的耐热性和抗蛋白酶降解能力。目前已发现MT-Ⅰ/Ⅱ可与Cu2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等20余种金属离子结合,且对不同金属离子具有不同的亲和力,这可能与其参与体内金属离子代谢及重金属解毒相关。
人类的MT基因位于16号染色体上,属于多基因家族,包括MT-Ⅰ(MT-A、B、E、F、G、H、M、X)、MT-Ⅱ(MT-2A)、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ11个功能基因[9],且基因结构基本相似,均含3个外显子和2个内含子,在3'非编码区都含有典型的多聚腺苷酸序列。MT-Ⅰ/Ⅱ基因表达具有高度可诱导性,可被金属离子、甾体激素、细胞因子、生长因子等多种因素诱导表达[10]。MT-Ⅰ/Ⅱ基因上游调节序列中存在多种转录调节元件,包括金属应答元件(metal response element,MREs)、糖皮质激素应答元件(glucocorticoid response element,GREs)、参与氧化应激的上游刺激因子-抗氧化应答元件(up stream stimulating factor-antioxidant response element,USF/ARE)、晚期转录因子-抗氧化应答复合元件(major late transcription factor antioxidant response element,MLTF/ARE)、白介素-6(IL-6)应答元件及转录因子Sp1结合位点等。但是,有研究[11]表明,糖皮质激素只是影响了MT-Ⅰ/ⅡmRNA的翻译,并未在转录水平起作用。
炎症细胞因子主要由活化的免疫细胞产生,同时又作用于免疫细胞,影响其活化及功能,在免疫激活、免疫应答、炎症放大及炎症抑制等方面起重要作用,体内炎症细胞因子水平直接反应机体所处炎症状态。例如IL-6是体内重要的促炎细胞因子,中枢神经系统损伤时IL-6具有控制氧化损伤、调控神经元凋亡、促进康复的作用,但体内IL-6水平过高又可引起大量炎症因子表达,加重神经元损伤[12]。IL-10是体内强效抗炎细胞因子,可抑制巨噬细胞和树突状细胞的抗原提呈能力,减少TNF-α、IL-1、IL-6等促炎细胞因子的产生,避免组织因炎症因子产生过度所致的病理改变,但IL-10过度表达又可导致免疫抑制,影响机体清除病原体的能力,最终导致感染加重,甚至出现代偿性抗炎症反应综合征(compensated anti-inflammatory response syndrome,CARS)[2]。因此,维持体内抗炎/促炎细胞因子动态平衡与疾病的转归息息相关。MT-Ⅰ/Ⅱ基因上游调节序列含IL-6应答元件,推测MT-Ⅰ/Ⅱ可能参与维持体内IL-6平衡。大量研究[13-14]表明,MT-Ⅰ/Ⅱ可调节IL-6、IL-1β、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、MIP-2、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等细胞因子的释放,从而减轻脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)所致的肺组织炎症损伤程度。其调节炎症细胞因子表达的机制推测可能与TLR4/NF-κB信号通路相关。研究表明,TLR4/NF-κB信号通路是炎症信号传递、级联放大的主要信号通路之一。TLR4是Toll样受体家族中重要成员,广泛存在于各组织和器官细胞膜,尤其是单核/巨噬细胞,是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁。NF-κB是真核生物细胞内一个核转录因子蛋白家族,参与调节体内多种病理生理相关基因表达,如免疫应答、炎症反应、应激反应和细胞凋亡等[15]。其中P65∶P50异源二聚体是NF-κB转录因子家族主要成员,平时与IκBα结合,以非活化的形式稳定存在于胞浆中,当TLR4与配体结合,激活下游NF-κB,P65∶P50异源二聚体与IκBα分离活化进入细胞核调控基因表达。因此,NF-κB是调节免疫的重要靶点。已有研究[16]表明,MT-Ⅰ/Ⅱ通过抑制NF-κB激活,减少促炎细胞因子水平,从而改善年龄相关性心肌病。郭隽等[17]研究也发现,MT-Ⅰ/Ⅱ通过其抗氧化作用间接抑制NF-κB激活,以至影响整个炎症网络,减轻LPS所致的急性肝损伤。
巨噬细胞、T细胞、B细胞是机体主要免疫效应细胞,这些细胞的活化状态在一定程度上反应机体免疫水平。如巨噬细胞根据体内微环境不同可极化为两种功能迥异的亚型,经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。其中M1型巨噬细胞具有很强的促炎作用和抗原提呈能力,而M2型巨噬细胞则具有抑制炎症和促进组织修复的作用[18]。近年来越来越多的研究表明,糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖等疾病是体内免疫平衡失调,机体长期处于慢性炎症刺激所致,与体内单核巨噬细胞激活平衡失调密切相关。这些细胞膜上存在MT-Ⅰ/Ⅱ结合位点,与MT-Ⅰ/Ⅱ结合后,抑制白细胞激活、增殖,促进单核巨噬细胞替代活化[4,19]。CD4+Th细胞在调节细胞免疫及体液免疫中起重要作用,其激活依赖于细胞内锌离子浓度[20],锌是机体必须微量元素,感染、损伤均可引起锌稳态改变。Shih等[21]研究也发现,Zn2+可降低支气管平滑肌细胞炎症因子(IL-6、IL-8、IL-1、MCP-1)的合成。Zn2+是诱导MT-Ⅰ/Ⅱ高表达的重要金属离子之一,而MT-Ⅰ/Ⅱ又可结合大量的Zn2+,是细胞内Zn2+储存器,与锌转运蛋白共同维持细胞内Zn2+稳态。Pankhurst等[22]研究发现,脑损伤后肝脏通过合成大量MT-Ⅰ/Ⅱ导致肝对锌离子的封存。因此,推测MT-Ⅰ/Ⅱ可能通过直接作用于免疫细胞或通过维持细胞内锌离子的稳态间接参与调节免疫细胞迁移活化,从而调节免疫。
氧化损伤是炎症损伤的主要机制,因此避免氧化损伤是减轻炎症损伤的重要手段。活性氧(reaction oxygen species,ROS)是细胞内氧化还原反应的正常代谢产物,包括过氧化物、超氧化物、单体氧、臭氧和有机氧化物等,其产生和清除处于动态平衡,炎症损伤时平衡被打破,ROS产生过度,引起组织氧化损伤。线粒体氧化呼吸过程中释放ROS,是细胞内源性ROS的主要来源,同时ROS又可抑制呼吸链,减少ATP生成[23-24],影响细胞能量供给,进一步增加ROS产生,形成恶性循环。MT-Ⅰ/Ⅱ作为体内重要的抗氧化调节剂和自由基清除剂,其结构中含大量的巯基,且这些巯基均处于还原状态,是其发挥抗氧化作用的活性中心,其清除羟基自由基的能力是谷胱甘肽(glutathione,GSH)的100倍[25],可对ROS直接猝灭,从而避免ROS对酶及相关蛋白的损伤。研究[24,26]还发现,MT-Ⅰ/Ⅱ可抑制三羧酸循环关键酶琥珀酰辅酶A及呼吸链中ATP合成酶硝基化,增加葡萄糖利用及能量供应,这对于稳定线粒体的功能乃至细胞代谢具有重要意义。例如稳定的线粒体功能是修复神经损伤所必须的,MT-Ⅰ/Ⅱ可通过调节线粒体功能减轻神经损伤、促进损伤修复[27]。研究[28- 29]还发现,MT-Ⅰ/Ⅱ可抑制ROS合成酶的活性,如细胞色素P4502E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)、一氧化氮合酶、环加氧酶-2,可直接减少ROS的产生,从而减少ROS对组织的氧化损伤。同时,ROS以细胞内第二信使身份参与转录因子NFκ-B、MAPKs的激活、核转位和靶基因表达调控,引起炎症因子释放,放大炎症反应[23]。MT-Ⅰ/Ⅱ做为NFκ-B、MAPKs重要调节剂,参与调节其下游信号通路引起的一系列病理生理进程[9,16-17]。
血管反应是炎症反应的中心环节,其中血管内皮细胞在调节血管功能中起主导作用。炎症因子、氧自由基及各种理化因素均可导致内皮细胞损伤,引起内皮细胞功能障碍。血管内皮细胞损伤及功能障碍是糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖等慢性炎症性疾病发生、发展的重要病理基础,同时也在脓毒症等急性炎症性疾病始动过程中扮演重要角色[30]。因此维持内皮细胞功能稳定对调节炎症反应具有重要意义。研究[13-14]表明,MT-Ⅰ/Ⅱ在维持内皮的完整性及凝血/纤溶系统稳定性方面具有重要作用。其机制尚不明确,可能与调节活化蛋白C、血管假性血友病因子(von willebrand factor,vWF)相关。也有报道[31- 32]称,MT-Ⅰ/Ⅱ通过调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,参与调节血管内皮细胞增殖/凋亡。
生物体进行生命活动的基础是通过酶或功能蛋白参与一系列生化反应实现的,而金属离子是大部分酶或功能蛋白激活所必须的,如Zn2+参与机体300余种酶和功能蛋白的组成。MT-Ⅰ/Ⅱ做为细胞内Zn2+储存器,Zn-MT携带大量的Zn2+,供给锌促进去锌蛋白及一些酶的活性和基因表达。如Zn-MT可为SOD、GSH-Px等提供Zn2+,加强抗氧化酶的活性,减少GSH降解。Ren等[33]在研究MT-Ⅰ/Ⅱ在百草枯引起的急性肺损伤中的作用发现,MT-Ⅰ/Ⅱ可增加抗氧化酶活性,降低体内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。动物实验研究还发现,炎症损伤时MT-Ⅰ/Ⅱ可增加血浆α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)含量,APG是一种血浆载糖蛋白,在急性反应高表达中起抗炎和免疫调节作用[34-35]。Kimura等[36]研究发现,AGP与MT-Ⅰ/Ⅱ一样,基因表达都受MRE结合转录因子1(metal response element-binding transcription factor-1,MTF-1)的调控。MTF-1是一种锌指转录因子,可被Zn2+激活从而调控AGP与MT-Ⅰ/Ⅱ表达。
MT-Ⅰ/Ⅱ作为可被多种机制诱导高表达的细胞内源性高效保护剂,在增强机体适应能力方面具有显著作用;同时,MT-Ⅰ/Ⅱ做为一种多功能蛋白,参与调节炎症反应作用机制是涉及多途径的复杂过程,目前尚未完全清楚。随着研究的深入,发现越来越多的疾病是体内炎症平衡改变所致,如糖尿病、高血压、肿瘤、衰老等,因此,对MT-Ⅰ/Ⅱ在炎症中的作用机制进行深入研究,更全面深入地了解其作用靶点,可能为治疗炎症性疾病开辟新思路。
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