α胰蛋白酶H4重链在病毒性肝炎相关性原发性肝细胞癌早期预警中的价值

胡高娃，李 波，徐 飞

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，占原发性肝癌的70%～90%，在恶性肿瘤中病死率居于第3位，仅次于胃癌和食道癌。90%以上的HCC病例是由慢性肝病发展而来，而其中最主要的是肝炎肝硬化，约占80%以上[1]。美国肝病研究协会推荐采用血清学标志物AFP和超声检查对肝硬化人群进行普查，以提高早期肝癌的检出率，但AFP对HCC的诊断灵敏度只有39%～65%，仅通过AFP进行普查可能会导致漏检[2]。另外，在许多慢性非恶性肿瘤患者血清中AFP浓度也有升高，采用AFP进行HCC筛查也可能导致5%假阳性。早期筛查方法灵敏度不足导致60%以上的HCC患者在晚期才被确诊，错过了治疗的最佳时期，这些被晚期确诊的HCC患者5年生存率＜16%，早期接受治疗的患者5年生存率可达到75%以上[3]。如果能及时发现甚至在尚未发生HCC时对肝硬化患者进行预警，进行合适的干预，可以显著降低HCC的病死率。目前，AFP和其他HCC血清标志物在早期预警方面的价值尚不明确。

α胰蛋白酶H4重链（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4）是分子量为120 kDa的血清糖蛋白，由肝脏分泌至血循液环中，属于急性时相反应蛋白。ITIH4在功能上主要参与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分的分泌和形成调节。目前文献报道，ITIH4可能通过下调IL-6表达从而参与HCC的发生和发展。IL-6通过与其受体结合，继而活化胞内一系列信号蛋白分子，最终实现IL-6反应基因的表达。目前认为IL-6及其受体介导的信号通路与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移密切相关[4-5]。在本研究中，通过对病毒性肝炎导致的肝硬化患者进行随访，验证ITIH4作为HCC早期预警和诊断标志物的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象 109例患者均为解放军第三〇二医院门诊和住院患者，开始研究时间为2013年1月，经过2年随访，研究结束时间为2015年12月。患者纳入标准：①具有5年以上HBV或HCV感染史；②年龄＞35岁；③临床明确诊断为肝硬化且排除恶性肿瘤的患者。排除标准：①患者伴随严重的并发症和其他系统性疾病；②接受过与肝病相关的侵入性治疗方案；患者最终诊断通过MRI检查确认，所有患者均签署知情同意书，由医院伦理委员会批准实施。患者经过2年的随访，观察患者是否进展为HCC，诊断结果以MRI检测结果作为金标准，进展为HCC的患者为HCC组，未进展为HCC的患者为非HCC组。

1.2 随访方案 患者在首次纳入本研究后即进行血清样本采集，随后进行随访，每隔半年进行1次MRI检查，如确诊已进展为HCC，则随访结束，并于确诊时间点再次采集血清样本，如2年内未进展为HCC，则随访研究结束。

1.3 样本采集 清晨空腹禁水状态下抽取肘静脉血约3～5 ml于带分离胶的真空采血干燥管， 离心后分离血清备用。

1.4 实验操作 ITIH4酶联免疫吸附试剂购自武汉伊艾博科技有限公司，按试剂使用说明书操作，将试剂平衡至室温，加样孔加入样本100 μl，并设置标准孔、空白孔，混匀后，37 ℃孵育120 min，弃去液体，加溶液A100 μl，37 ℃孵育60 min，弃去液体，洗板3次，每孔加溶液B100 μl，37 ℃孵育60 min，洗板5次，加入底物液90 μl，37 ℃避光显色15 min，加终止液50 μl，用酶联仪在450 nm波长检测各孔OD值，并根据标准曲线计算ITIH4浓度。

1.5 统计学处理 用SPSS 17.0软件进行统计分析。定量资料呈正态分布者用±s表示，非正态分布者用中位数（最小值，最大值）表示，2组比较用成组t检验或Wilcoxon秩和检验，发生HCC前后比较用自身配对t检验。用ROC曲线分析ITIH4和AFP对HCC的预测价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 随访结果 2组患者入组时基本情况见表1。109例患者随访2年后，共有29例发展为HCC（腹部MRI增强确诊），发病率为26.6%。患者年龄（53.9±9.7）岁，男66例（60.6%），女43例（39.4%）。103例为HBV感染导致肝硬化（94.5%），见表1。

表1 HCC组与非HCC组基本情况Table 1 Basic data of group HCC and non-HCC group

2.2 ROC曲线分析 HCC组ITIH4水平低于非HCC组（P=0.000），ROC曲线显示其预测HCC的AUC为0.726（P=0.000）。HCC组AFP水平高于非HCC组（P=0.021）。AFP预测HCC的AUC为0.657（P=0.013），小于ITIH4的AUC（P=0.000），见表2和图1。

从ROC曲线获得ITIH4预警HCC的诊断界值为12.27 ng/ml，其灵敏度为40.0%，特异度为93.1%；AFP预警HCC的诊断界值为4.76 ng/ml，其灵敏度为86.2%，特异度为41.3%。

2.3 17 例患者发生HCC前后ITIH4和AFP水平变化 将17例发展为HCC的患者入组时首次检测血清和确诊为HCC时的血清ITIH4和AFP水平进行比较，发现患者ITIH4水平在发展为HCC后有所下降（P＜0.05），而AFP变化差异无统计学意义。见表3。

3 讨 论

鉴于AFP的灵敏度（39%～65%）难以满足临床需求，而影像学和病理学检查价格昂贵，患者依从性差，所以近年来对HCC新的诊断标志物研究成为肿瘤诊断领域的热点。

在本文的研究中，我们通过2年的随访和样本采集检测工作，积累了HCC患者完整的序列样本，对随访患者血清进行ITIH4浓度检测，发现ITIH4在发展为HCC和未发展为HCC的肝硬化患者血清中存在显著差异，提示ITIH4具有潜在的HCC预警价值。我们同时将ITIH4与临床常用的AFP进行比较，发现ITIH4预警AUC大于AFP，但AFP灵敏度高于ITIH4，而ITIH4的特异度要高于AFP。

ITIH4属于急性时相反应蛋白，是胰蛋白酶抑制物（inter-alpha-trypsin inhibitor, ITI）的一条重链。ITI的重链包括ITIH1～ITIH5，其中ITIH4基因定位于3号染色体短臂，目前被发现与多种实体肿瘤的发生、发展及侵袭以及转移密切相关。ITIH4主要参与ECM的分泌和形成调节。我们在肝硬化患者血清中发现了该蛋白的高表达，可能与该蛋白参与ECM形成有关。ITIH4可能通过下调IL-6表达从而参与HCC的发生和发展，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，通过与透明质酸结合参与ECM稳定形成的过程，该蛋白由肝脏分泌至血液循环中，通过免疫学方法可以测量其在血清中的浓度。很多报道证实ITIH4在各种实体肿瘤中的表达具有差异，有研究发现，通过蛋白质组学定量技术观察大肠腺癌鼠模型血清中的差异蛋白质，发现血清ITIH4浓度在肿瘤发生过程中有显著改变，证实该蛋白具有早期诊断价值[6]。Subbannayya等[7]通过iTRAQ技术发现在胃腺癌的患者中，血清ITIH4水平显著升高。Yang等[8]则通过蛋白质谱技术发现ITIH4是乳腺癌的潜在诊断标志物。Gangadharan等[9]采用2D电泳技术对肝纤维患者和正常对照患者血清蛋白质成分进行研究，也发现了在肝纤维化患者血清中ITIH4浓度也显著升高。Noh等[10]发现ITIH4水平与HCC患者预后显著相关，其数据显示ITIH4浓度在正常对照、肝硬化和HCC患者血清中浓度存在显著差异，肝硬化和HCC患者血清浓度高于正常对照，但HCC患者血清浓度也低于肝硬化患者，说明在HCC发生后，ITIH4表达可能下调，但该报道采用的是横断面研究，其结果缺乏说服力。

表2 HCC组和非HCC组血清AFP及ITIH4水平[中位数（最小值，最大值）, ng/ml]Table 2 Serum AFP and ITIH4 levels in group HCC and non-HCC group [M(min, max), ng/ml]

图1 ITIH4和AFP预测HCC的ROC曲线Figure 1 ROC curve of ITIH4 and AFP for predicting HCC

表3 17例患者进展为HCC前后体内ITIH4和AFP水平[中位数（最小值，最大值），ng/ml]Table 3 Serum ITIH4 and AFP levels before and after the progression of HCC in 17 patients [M(min, max), ng/ml]

本文采用前瞻性的随访研究，观察了患者在动态发展过程中ITIH4血清浓度的变化，进一步证实了该蛋白水平在发展为HCC后会显著降低，同时对不同结局的样本检测表明，HCC高风险的患者中也存在ITIH4低表达的情况。因此，该蛋白可以作为预警标志物，定期监测可以实现HCC的早发现，对肝硬化患者的预后也可以起到一定的指导意义。但本研究受样本量的影响，其结果存在一定的偏倚，后续研究须进一步扩大样本量，进行大样本、多中心和长期的随访研究，进一步明确ITIH4在HCC早期诊断和预警中的价值。

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