苦杏仁中苦杏仁苷的闪式提取工艺研究

禹琦

（湖南娄底市中心医院，湖南 娄底 417000）

苦杏仁为蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏 Prunus sibirica L.、东北杏 Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne或杏Prunus armeniaca L.的夏季采收的干燥种子。具有降气止咳平喘、润肠通便之功能。常用于咳嗽气喘、胸满痰多、肠燥便秘［1］。其主要有效成分是苦杏仁苷，也称维生素 B17，具有止咳［2］、平喘［3］之功能，此外，其对心血管［4］、消化系统［5-6］、免疫系统［7-8］、泌尿系统等［9］也具有药理作用。

目前关于苦杏仁苷的提取报道较多，主要是煎煮、回流、超声等传统方法，都存在提取时间较长、溶剂消耗大、能耗大等问题。苦杏仁苷是一种氰苷类物质，分为D型和L型，前者有药理活性后者却没有。而D型苦杏仁苷在高温下会转变成L型从而失去药理活性［10］。所以常规提取方式有可能会引起D型苦杏仁苷的异构化，而导致失活。闪式提取技术是一种新型提取方法，它是利用闪式提取器将浸泡在溶剂里的物质快速破碎，并通过超强振动与高速搅拌让有效成分迅速释放出来的一种提取方法［11］。闪式提取时间短至几分钟甚至几秒钟，溶剂用量小，能耗低，且无须加热，有利于对热不稳定物质的提取［12-13］。目前还未见到有关苦杏仁苷闪式提取法的报道。笔者通过实验研究闪式提取法提取苦杏仁苷，希望为苦杏仁苷的提取提供一种新的思路和方法。

1 仪器与试药

JHBE—50S闪式提取器（河南金鼐科技发展有限公司）；Agilent1100液相色谱仪；BT224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；XL-60C型中药粉碎机（湖南旭众机械设备有限公司）。

苦杏仁苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110820-201607）；苦杏仁（长沙佰佳中药饮片有限责任公司）；乙腈为色谱纯；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苦杏仁苷的含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；检测波长：207 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 将苦杏仁苷对照品干燥至恒重，精密称量10.3 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至100 mL，摇匀，制成质量浓度为103μg·mL-1的苦杏仁苷对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 将苦杏仁粉碎，过二号筛，精密称量粉末约0.3 g，按相应实验条件制备出提取液，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至浸膏，减压干燥，得提取物。精密称量提取物20 mg，放入容量瓶中，精密加入甲醇100 mL，摇匀使其完全溶解，过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.1.4 HPLC法专属性 取对照品溶液和供试品溶液分别进样测定，供试品和对照品色谱图在相应时间有对应色谱峰，且供试品色谱图中苦杏仁苷色谱峰与其他组分分离良好，结果见图1。

图1 对照品和供试品的HPLC图

2.1.5 标准曲线的建立 取干燥至恒重的苦杏仁苷对照品15.1 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至50 mL，摇匀。精密量取上述溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别移入甲醇至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以苦杏仁苷浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y＝9.144 8X+3.521 1，r＝0.999。表明苦杏仁苷在30.2～302μg·mL-1有良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 取苦杏仁苷对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件重复测定6次，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量，并计算得RSD值为1.05%。表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 配制供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按2.1.1项下色谱条件测定6次，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量，并计算得RSD值为1.31%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一批苦杏仁，精密称取6份，分别按2.1.3项下制备成供试品溶液，并按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量，并计算得RSD值为1.53%。说明其重复性良好。

2.1.9 回收率试验 采用加样回收法，精密移取已知含量的苦杏仁6份，每份约0.15 g，加入对照品溶液适量，挥干溶液。按2.1.3项下制备并按2.1.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量，结果苦杏仁苷的平均回收率为98.56%，RSD为1.71%。说明回收率良好。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）

2.2 闪式提取工艺的考查

2.2.1 脱脂和提取次数考查 由于苦杏仁内含有大量油脂，有文献［14-15］报道，提取前需进行脱脂，所以笔者先对脱脂工艺进行考查，同时考查提取次数。精密称量苦杏仁粉末6份，每份约0.3 g，其中3份样品（记为A1、A2、A3）不用石油醚脱脂，另外3份用石油醚（记为B1、B2、B3）脱脂，其余提取条件都相同：提取电压为100 V，溶剂为70%乙醇，料液比（g∶mL）为1∶10，提取时间为1 min。按2.1.3项下制备并按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量。结果见表2。

表2 脱脂和提取次数对苦杏仁苷提取的影响（n＝3）%

由结果可知，脱脂和不脱脂对苦杏仁苷的提取含量没有影响；且第一次提取已将苦杏仁苷基本提取完全。所以确定提取时无须脱脂，提取次数为一次。

2.2.2 电压强度的选择 精密称量苦杏仁粉末4份，每份约0.3 g，选取60、80、100、120 V 4种强度电压进行考查。其余提取条件都相同：溶剂为70%乙醇，料液比（g∶mL）为1∶10，提取时间为1 min，提取次数1次。按2.1.3项下制备并按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积，算出苦杏仁苷含量。结果见图2。

图2 电压强度对苦杏仁苷提取的影响（n＝3）

由结果可知，提取电压为100 V时提取含量最高，故选择电压为100 V。

2.2.3 正交试验 参考有关文献［16-17］，并通过单因素试验，采用L9（34）正交设计，选择乙醇浓度、料液比（g∶mL）和提取时间3个因素进行正交试验，优选最佳工艺。因素水平表见表3，试验结果和方差分析分别见表4～5。

表3 因素水平考察表

表 4 L9（34）正交试验结果

表5 正交试验方差分析

由表5可知，因素A（乙醇浓度）和因素C（提取时间）对提取结果有显著性影响，而因素B（料液比）则无显著性影响。三个因素影响的顺序是A（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞B（料液比）。综合结果，优选出最佳闪式提取工艺为A2B1C1，即70%乙醇，料液比1∶6，提取时间1 min。

2.3 验证试验

在正交试验中没有A2B1C1最佳工艺组合，为验证此工艺的可靠性，精密称取苦杏仁3份，按优选出的最佳工艺组合进行提取，计算苦杏仁苷含量。结果分别为3.82%、3.88%、3.85%，证明此工艺合理，重复性好。

2.4 提取方法比较

采用乙醇回流法［18］和水提法［19］做为对照，采用文献中所提供的方法提取苦杏仁苷，并计算含量和转移率，与闪式提取法结果对比，结果见表6。

表6 各提取方法的比较（n＝3）

由结果可知，相比另外两种方法，闪式提取法无论从提取次数、提取时间、料液比还是苦杏仁苷的含量和转移率都较好。

3 讨论

近年来对苦杏仁苷的提取研究较多，但还未见闪式提取方法的报道。本实验通过单因素考查和正交试验确定了闪式提取法的最佳工艺，即不须脱脂，提取次数为一次，电压为100 V，溶剂为70%乙醇，料液比为1∶6，提取时间为1 min。该工艺简单、节能，苦杏仁苷的含量和转移率都较好，有利于苦杏仁药物的综合利用与开发。

笔者在正交试验之前，对乙醇浓度、料液比和提取时间3个因素分别进行了单因素考查，得到的最优水平分别为70%、1∶8和1.5 min，然后再选取此水平以及高低两个水平进行正交试验。

传统提取方法为水提、醇提、超声等提取方式，水提、醇提等提取时间一般需3 h，超声提取时间也需30min以上，而闪式提取法仅仅只需1min，大大缩短了提取时间，该方法工艺简单、高效节能。并且闪式提取法是将物质快速破碎，通过超强振动与高速搅拌让有效成分迅速释放出来的一种提取方法，无需加热，不会破坏有效成分。所以闪式提取法是一种具有发展前景的新技术。

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