肠道微生态对肿瘤免疫治疗的影响

金 怡，郑 怡，张航瑜，赵 鹏，涂晓璇，吴 伟，刘璐璐，方维佳

免疫系统是控制肿瘤的主导力量，免疫监视功能低下可导致肿瘤发生、发展[1]。近年来，肿瘤免疫治疗开辟了肿瘤治疗的新方向，然而除了微卫星高度不稳定患者外，获益人群仍不明确。目前报道的程序性细胞死亡蛋白配体1（programmed cell death protein 1 ligand 1, PD-L1）的免疫组化表达和肿瘤突变负荷均无法明确预测免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的疗效[2]。有研究指出，肠道微生态参与了肿瘤的发生、发展，并影响肿瘤免疫治疗效果。肠道菌群被认为是一个潜在的可预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物，因此，调控肠道微生态也成为了免疫治疗的一个部分。

1 肿瘤免疫治疗的挑战

目前肿瘤治疗的重点已从靶向肿瘤细胞本身转移到宿主的免疫系统。“肿瘤免疫周期”的正常运行是保证抗肿瘤免疫疗效的前提[3]。肿瘤免疫逃逸在肿瘤发生、发展中发挥着关键作用[1]。T细胞介导的细胞免疫是参与肿瘤免疫治疗的主要免疫反应，其发挥有效的抗肿瘤效应须将初始T细胞活化增殖和分化成效应T细胞[4]。近年来，ICIs在肿瘤免疫治疗中取得了较好的进展。ICIs包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4）抗体、抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1,PD-1）抗体以及抗PD-L1抗体[5-6]。目前多种ICIs已经相继被FDA批准用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤等[7]。但免疫治疗单药疗效只有20%左右。如何找到获益的人群，如何扩大获益的人群，成为肿瘤免疫治疗面临的新挑战。

2 肠道微生态与肿瘤免疫治疗

2.1 肠道微生态参与机体免疫调节 人类肠道微生物的数量庞大、种类繁多，被称为人类的“第二基因组”，它不仅参与形成肠道局部免疫屏障[8]，还可诱导人类T细胞和B细胞活化[9-10]，使免疫系统识别和攻击机会性细菌[11]，在多个层次上促进先天免疫和适应性免疫应答。有研究报道无菌小鼠在免疫方面存在严重缺陷，其体内NK细胞功能受损，单核吞噬细胞不能产生γ-干扰素[12]。肠道微生物对免疫系统的影响并不局限于肠内，在肠外诸多自身免疫疾病和慢性免疫疾病的病理发展中也都起着重要作用，甚至直接与患病机制有关[13-14]。

2.2 肠道微生态失调促进肿瘤形成 肠道微生态的改变可能通过几种机制影响肿瘤发生、发展。第一，通过微生物或其代谢产物直接致癌。第二，破坏肠上皮的屏障功能，使免疫细胞接触细菌内毒素和抗原。第三，细菌内毒素和抗原通过改变免疫细胞和促炎性因子刺激炎症形成和免疫反应。第四，诱导DNA损伤和信号通路异常[15]。

2.3 肠道微生态变化可预测肿瘤发生 越来越多证据表明肿瘤的发生、发展与肠道微生态变化有关。Zitvogel等[16]的研究成果提示九大癌症（急性淋巴细胞白血病、头颈部鳞状细胞癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、人类乳头瘤病毒相关性宫颈癌、尿路上皮癌）均与特定的肠道微生态组成及丰度表达相关。Dai等[17]对来自5个国家的526例粪便标本进行宏基因组分析，发现结直肠癌患者肠道内富集脆弱拟杆菌、具核梭杆菌等7种细菌，另有62种细菌减少。这些潜在的诊断性细菌标志物可用于结直肠癌无创性诊断。

3 肠道微生态调控肿瘤免疫治疗的机制研究

3.1 有益肠道菌群可增强肿瘤免疫治疗效果

3.1.1 基础研究 2015年11月，《科学》杂志发表了2篇文章，首次将肠道微生态与ICIs疗效联系起来。美国团队发现抗PD-L1单抗治疗在基因相似的Jackson Laboratory （JAX）小鼠中比在Taconic Farms（TAC）小鼠中更有效，原因在于肿瘤特异性T细胞应答在JAX小鼠中显著高于TAC小鼠[18]。而双歧杆菌通过增强树突状细胞（dendritic cell, DC）的活化，提高TAC小鼠抗肿瘤作用。DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用[19]。法国团队研究表明抗CTLA-4单抗不能抑制无菌小鼠或抗生素治疗小鼠中的肿瘤生长[20]。而类拟杆菌、脆弱拟杆菌和洋葱伯克氏菌可增加Th1免疫应答，促进瘤内DC的成熟，恢复小鼠对CTLA-4单抗的抗癌反应[20]。因此，通过粪菌移植（fecal microbiota transplantation,FMT）或口服上述菌群，可消除以上治疗差异。

2017年，Uribe-Herranz等[21]研究发现过继性T细胞治疗（adoptive T cell therapy, ACT）的功效也受肠道微生态组成、抗生素治疗以及FMT的影响。肠内富集多种拟杆菌有助于控制Harlan小鼠肿瘤生长。万古霉素通过增加血清CD8α+DC和IL-12的数量，可提高JAX小鼠对ACT治疗的反应。同年，法国Gustave Roussy癌症中心研究团队对接受来自ICIs治疗无反应患者粪便移植的小鼠，通过口服补充Akkermansia muciniphila，增加肿瘤床募集CCR9+CXCR3+CD4+T细胞，增加CD4/Foxp3比例，诱导DC分泌IL-12，恢复小鼠对PD-1阻断的反应[22]。

3.1.2 临床研究 一项来自法国Gustave Roussy癌症中心的研究对接受过ICIs治疗的249例患者进行分析，发现Akkermansia muciniphila普遍存在于对ICIs治疗反应良好的患者体内，而使用氨苄青霉素+黏菌素+链霉素的患者无进展生存期和中位总生存期皆短于前者[22]。2组患者的无进展生存期分别为4.1个月和3.5个月（P=0.007），中位总生存期分别为20.6个月和11.5个月（P＜0.001）。美国安德森癌症中心前瞻性地收集并分享转移性黑色素瘤患者微生物样本，发现抗PD-1单抗治疗后有效患者的菌群多样性显著高于无效患者[23]。有效患者体内富含粪杆菌、梭菌和疣微菌，有较高丰度的CD4+T和CD8+T细胞以及抗原加工和呈递的标志物。无效患者体内则富含拟杆菌目、大肠杆菌等，有较高丰度的调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）和骨髓来源的抑制细胞（myeloidderived suppressor cells, MDSCs）。Tregs是一类控制自身免疫反应性的T细胞亚群，可抑制CD8+T细胞、NK细胞、B细胞和抗原提呈细胞等多种免疫活性细胞[24]。MDSCs是骨髓来源的一群异质性细胞，可促进Tregs细胞扩增，诱导PD-L1分子表达，抑制抗原提呈[25]。

Matson等[26]在16例抗PD-1单抗治疗转移性黑色素瘤有效患者中检测出包括青春双歧杆菌、乳酸杆菌和长双歧杆菌等在内的8种高丰度菌种物种。无效患者只有2种高丰度细菌：瘤胃球菌和Roseburia intestinalis。青春双歧杆菌可导致外周衍生的Tregs减少。且该研究认为有益菌群/无益菌群＞1.5有更好的免疫治疗效果。Chaput等[27]发现在伊匹木单抗治疗的黑色素瘤中，基线富含粪杆菌等厚壁菌门的肠道微生物群（A群）可预测更好的临床反应。与基线富含拟杆菌属（B群）的患者相比，A群患者有更长的无进展生存期（P=0.0039）。A群患者中CD4+T细胞及诱导型T细胞协同刺激因子（inducible T cell costimulator,ICOS）明显增加，血清中可溶性炎症标志物sCD25增加。其中ICOS被认为是伊匹木单抗疗效的生物标志物[28]，sCD25则与T细胞的主要生长因子IL-2浸润有关。

3.2 有益肠道菌群可预测并改善肿瘤免疫治疗不良反应 免疫相关性结肠炎是最常见的与抗CTLA-4单抗相关的不良反应。一项前瞻性临床研究提示，拟杆菌和涉及多胺转运、B族维生素生物合成的肠道菌群在未发生结肠炎的患者中更为丰富。根据这些信息构建了预测发生结肠炎风险的模型，其灵敏度为70%，特异度为83%[29]。Chaput等[27]的研究也发现未发生结肠炎的患者，基线时全身炎症因子和拟杆菌比例较高。拟杆菌和Burkholderiales的混合物可改善抗生素处理小鼠中抗CTLA-4单抗诱导的亚临床结肠炎和结肠炎症评分[17]。故推测高丰度的拟杆菌可作为预测未发生免疫相关性结肠炎的标志物。目前抗CTLA-4单抗和抗PD-1单抗被批准联合用于治疗黑色素瘤，可增加有效率（50%～60%）和延长无进展生存期[30]。然而，联合用药有接近60%的3～5级不良事件，40%的患者因毒性而中断治疗[30]。因此，将检测基线肠道菌群作为预测因子，用于鉴别联合用药与单药治疗的患者，以减少严重不良事件的发生。

综上所述，动物实验与临床试验研究得出了相似的结论：①肠道微生态组成差异决定机体免疫差异，从而决定肿瘤免疫治疗差异。肠道微生态能预测肿瘤免疫治疗效果，通过补充特定的有益肠道菌群及促使肠道微生态多样化有助于获得更高的有效率。②肠道微生态能预测并改善肿瘤免疫治疗的不良反应。③多种抗生素可破坏ICIs抗肿瘤效应，但万古霉素可增强ICIs疗效。但上述研究得出的影响免疫治疗的肠道菌群不尽相同，可能与瘤种、人种和所选药物相关。此外，上述研究对肠道微生态改善肿瘤免疫治疗效果的机制进行了简单的探讨。多样化和高丰度的有益肠道菌群（如粪杆菌、疣微菌）可增强抗原递呈介导的抗肿瘤免疫应答，并改善效应性T细胞功能及肿瘤微环境。相反，有害肠道微生物群（如大肠杆菌）使得抗原呈递能力减弱而影响免疫治疗效果[23]。

4 肠道微生态提高肿瘤免疫治疗效果的开拓性研究

既往的免疫治疗往往关注疗效和毒副反应。随着对肠道微生态的认识加深，肠道微生态的调控也将被纳入免疫治疗的全程管理中。有研究提出使用益生菌、益生元、合生元、抗生素或FMT与肿瘤免疫治疗相结合，可以重新平衡肠道微生态[31]，本文仅重点讨论FMT与抗生素的应用。

4.1 有益菌群的粪便移植 FMT是通过鼻胃管、鼻十二指肠镜、内镜、灌肠来实现。多个研究提示将肿瘤免疫治疗有效的小鼠或患者的粪便移植到对肿瘤免疫治疗无效的小鼠体内，可提高ICIs的疗效[18，22]。富含 Akkermansia muciniphila[22]、双歧杆菌[18]等有益菌种的粪便可用于FMT。除了卫生问题外，这种方法面临的挑战还包括选择最佳捐助者和提供足够的材料以使多名患者长期重复治疗[32]。

4.2 抗生素的合理使用 从理论上讲，抗生素可以用来减少肠道中有害菌群的丰度，同时为有益菌群创造栖息地。然而，如何使用抗生素仍值得商榷。流行病学研究表明，反复使用广谱抗生素可致癌[33]。但实际上，包括多柔比星在内的蒽环类抗生素在化疗中广泛应用，这些抗生素可以诱导免疫原性细胞死亡，从而刺激抗癌免疫应答[34]。在肿瘤免疫治疗中，抗生素的使用可降低肿瘤疗效[20，22]，或增强疗效[35]或不影响疗效[36]。万古霉素治疗可增加CTLA-4抗体疗效，广谱抗生素则降低疗效。使用万古霉素可增加ACT的功效，但应用新霉素和甲硝唑时，ACT的功效没有改变[21]。然而，万古霉素对小鼠中环磷酰胺诱导的抗癌免疫应答则产生负面影响[37]。通过使用高选择性的抗生素来杀灭或阻止有害细菌生长，这种方法应仅适用于逆转对患者健康有危险时细菌的过度生长的情况[38]。在异基因造血干细胞移植过程中也倾向选择窄谱抗生素[39]，这些药物在移植后可能有助于最小化抗生素使用后某种程度上产生的细菌（例如粘液分解细菌：粘液螨）[40]。这表明抗生素介导的作用是依赖疾病背景的，可以是有利的也可以是有害的。因此，在肿瘤免疫治疗中可行的策略是避免反复使用广谱抗生素及利用特定抗生素的潜力。

5 问题与展望

部分有益菌群可作为生物标志物预测肿瘤免疫治疗的效果，含有高丰度的双歧杆菌、粪杆菌等有益菌的肿瘤患者可维持其免疫系统功能正常，为后续治疗提供可能。此外，基于抗生素在其他肿瘤免疫治疗中的负效应，在缺少足够证据支持的情况下，目前认为在免疫治疗前后，应避免使用抗生素。

当前，肠道微生态与肿瘤免疫治疗的研究仍存在很多问题：①各研究中发现的有益菌群不尽相同；②抗生素参与免疫治疗的增效/减效作用也不一致，抗生素使用时机、剂量、疗程及种类尚不明确；③肠道微生态在肿瘤免疫治疗中的机制尚有待进一步阐明；④目前研究的结论多来自动物实验，因此需要更多前瞻性的临床试验验证；⑤实现有益菌群改善ICIs治疗反应的最佳方法仍有待确定。目前，保持身体健康或导致疾病相关的特定菌群的作用仍不清楚，可能是一组菌群而不是一个特定的菌种。为了获得更好的肿瘤免疫治疗效果，降低免疫治疗毒性，期待开展更多的研究来鉴别肠道有益菌群，选出潜在治疗有效的人群，提早发现可能无效甚至易出现超进展的患者。在此基础上，进一步富集相应的“有益菌群”，更好地激活T细胞，或将成为提高肿瘤免疫治疗效果的有效途径。