Bortezomib对炎症性肠病小鼠模型炎症抑制作用及机制的研究

胡丽红， 李 晴， 曲 波， 张志荣

1.哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150086； 2.哈尔滨医科大学2014级临床医学本科

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎性病变，发病率在我国呈逐年上升趋势。但由于IBD的病因尚不明确，治疗上也缺乏特异性的药物，世界卫生组织将其列为难治性疾病之一[1-2]。目前的研究表明，在IBD中，活化的核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)可调节与IBD发生、发展相关的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)等的产生和释放，加重肠道的炎性反应[3]。由此提示，NF-κB的激活在调节免疫及炎性反应中起着关键作用，抑制NF-κB的活性可以起到治疗IBD的作用。而Bortezomib是进入临床研究的第一个蛋白酶体抑制剂，可有效抑制NF-κB活性，已被批准用于治疗多发性骨髓瘤[4]。本研究旨在以葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的IBD小鼠作为模型，评价Bortezomib是否可通过NF-κB的抑制作用达到治疗IBD的目的。

1 材料与方法

1.1动物选取8周龄健康雄性Balb/c小鼠，体质量20～25 g，共160只，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。小鼠常规饲养，保证环境清洁，通风良好，湿温度适宜(温度24～25 ℃，湿度70%～75%，照明方案12 L/12 D)。此方案经哈尔滨医科大学动物保护与应用委员会批准。在进行实验之前，将动物于实验室条件下饲养7 d。

1.2主要试剂Bortezomib由Ben Venue Laboratories Inc(Bedford，USA)提供。DSS(M.W.=36000-50000，上海翊圣生物科技有限公司)；ELISA试剂盒(北京义翘神州生物科技有限公司)；胞浆-核蛋白抽提试剂盒(PIERCE Biotech, USA) Cat:78833；BCA蛋白浓度测定试剂盒：Pierce公司 Cat：23227；非放射EMSA Kit：PIERCE公司 Cat：89880；成像系统：阿尔法公司flurechemical(made in USA)。

1.3造模与治疗160只小鼠随机分为5组：正常对照组，模型组和Bortezomib高、中、低剂量组(32只/组)。各组间质量差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组小鼠正常饮用水饲养。其余4组小鼠给予质量浓度为30 g/L的 DSS 溶液，连续饲养7 d[5]。Bortezomib低剂量治疗组(从腹腔入0.2 mg/kg Bortezomib)；Bortezomib中剂量治疗组(从腹腔入0.6 mg/kg Bortezomib)；Bortezomib高剂量治疗组(从腹腔入1.0 mg/kg Bortezomib)；模型对照组(从腹腔入PBS)；正常对照组(从腹腔入PBS)。分别于药物治疗前及用药后第1、3、7天4个时间点，从每组中随机抽取8只小鼠检测相关指标。

1.4疾病活动指数(diseaseactivityindex，DAI)评价Bortezomib对DSS诱导的IBD的治疗效果使用DAI评价IBD的临床活动。DAI指数由三部分组成：体质量下降、大便性状和血便情况。体质量减轻分数如下测定：0分：无体质量下降；1分：1%～5%体质量下降；2分：6%～10%体质量下降；3分：11%～15%体质量下降；4分：> 15%体质量下降。粪便性状评分如下：0分：正常大便；2分：大便松散；4分：腹泻。便血情况评分如下：0分：无便血；2分：潜血；4分：肉眼血便。三个类别分数相加取总分。

1.5组织病理学评价炎症程度在给药治疗前及给药后分别于第1、3和7天对小鼠实施安乐死。 在实验结束后，收集结肠组织，清洗，质量浓度为30 g/L的甲醛固定，石蜡包埋、切片，切片厚度为5 μm，并进行苏木精-伊红(HE)染色，用于光学显微镜(Olympus BX51 microscopy, Olympus, Japan)观察，最后由对实验方案不知情的病理学家进行观察和分级。收集剩余的结肠组织并冷冻在液氮中。组织染色分级标准见表1。

表1 组织染色分级标准Tab 1 Grading criteria for histological staining

1.6ELISA法检测Bortezomib治疗对TNF-α血清水平的影响实验动物处死前通过心脏穿刺收集血液，将血液静置后离心(3 500 r/min) 15 min， 按ELISA试剂盒操作步骤测定TNF-α(ng/L)的水平。

1.7电泳迁移率改变分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)法检测Bortezomib治疗对NF-κB活性的影响按核蛋白抽提试剂盒操作说明提取核蛋白;然后BCA法进行蛋白浓度测定;进行EMSA,其具体步骤为：配制质量浓度为65 g/L的聚丙烯酞胺凝胶；制备预冷的0.25×TBE，4 ℃保存；预电泳：用预冷的0.25×TBE在冰上120 V预电泳1 h，并在上样前用电泳缓冲液冲洗加样孔3～5次/孔；然后将细胞核提取物与NF-κB寡核苷酸探针进行结合反应,反应体系按总体积15 μl上样，并设置阴性对照组(标记探针)、常规反应组(含激活的NF-κB核蛋白+标记探针)、探针冷竞争反应组(含激活的NF-κB核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针)；制备上样混合液：电泳：将全部样品(18 μl)加于样品孔中，低温下180 V，电泳60 min。电泳后取出凝胶板,用电泳转膜装置将凝胶上的蛋白转至结合膜,交联、洗涤、底物结合反应、Cool Imager成像系统成像。

2 结果

2.1DAI评价Bortezomib对DSS诱导的IBD的治疗效果造模过程中无小鼠死亡，小鼠于造模开始第3天逐渐出现精神萎靡、毛发直立、肉眼血便，第5天出现血便，第7天均出现肉眼血便或便潜血阳性，严重者在出现肉眼纯稀血便的同时肛周黏附少量血液。造模7 d后小鼠体质量下降明显，降幅均超过原体质量的15%(见图1A、1B)。所有DSS处理组的DAI评分均明显增加，而在整个给药期间正常对照组DAI始终为0，造模组小鼠一般状态DAI评分(11.250±0.463)较正常对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)。

给予Bortezomib药物治疗后，与PBS治疗的模型组相比，Bortezomib低剂量治疗组治疗1 d DAI评分无显著降低。中剂量和高剂量Bortezomib组的DAI评分均显著降低(P<0.05)。Bortezomib不同剂量及时间处理后多因素方差分析结果显示，时间、剂量及时间和计量的交互作用对DAI影响，差异均有统计学意义(P<0.001)。总体趋势：随着药物浓度的增加及时间的延长，小鼠一般状态逐渐好转，DAI评分逐渐降低。应用高剂量Bortezomib治疗7 d后，IBD的症状显著改善，平均DAI评分仅为1.83分(见图1C)。

注：与模型对照组比较，*P<0.05。图1 小鼠便血情况及DAI值比较 A：DSS诱导5 d IBD小鼠模型；B：DSS诱导7 d IBD小鼠模型；C：给药期间小鼠体质量下降、大便性状和血便情况DAI评分Fig 1 Comparison of bloody situation in mice and DAI value A: DSS-induced IBD in mice model for 5 days; B: DSS-induced IBD in mice medel for 7 days; C: DAI score for body weight change, rectal bleeding and stool consistency during administration

2.2组织病理学评价炎症程度在正常对照组中，组织学染色显示结构正常，没有异常的组织变化和损伤(见图2A)。在DSS处理造模后，可以观察到黏膜损伤，结构破坏，明显的上皮细胞崩解，炎性细胞浸润，水肿和隐窝脓肿形成(见图2B)。应用中剂量和高剂量Bortezomib治疗3 d和7 d后，炎症和隐窝损伤显著改善，组织学评分也显著降低(见图2C和2D)。此外，低剂量Bortezomib治疗未能诱导组织学评分显著降低。高剂量和中等剂量的Bortezomib治疗能够达到DSS诱导的IBD组织病理学缓解。

2.3Bortezomib治疗对TNF-α血清水平的影响与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠TNF-α水平显著上调。随着Bortezomib治疗时间和剂量的增加，TNF-α的表达显著下调(见图3)。不同剂量及时间处理后多因素方差分析结果显示，时间、剂量及时间和计量的交互作用对TNF-α影响，差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.4EMSA法检测Bortezomib治疗对NF-κB活性的影响结肠组织核蛋白提取物显示，与正常对照组相比，应用DSS处理后的小鼠NF-κB p65蛋白活性显著上调(见图4)。然而，应用Bortezomib治疗后由DSS诱导引起的结肠黏膜中NF-κB p65活性升高则显著下调，并呈时间和剂量依赖性。

3 讨论

NF-κB是一种具有多向转录调节作用的蛋白质， 广泛存在于真核细胞中，参与许多疾病的发病机制。NF-κB家族5位成员包括：NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52、P49、P50B)、RelA(P65)、RelB、 c-rel。正常状态下，NF-κB家族成员通常以二聚体形式与其抑制蛋白IκB形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。只有在受到各种活化因素的作用，IκB蛋白激酶IKK活化，IκB被磷酸化并通过26S蛋白酶体顺序降解，与NF-κB解离，NF-κB活化进入细胞核内，其DNA结合位点暴露，与DNA启动子上特定的认知序列结合，调控NF-κB反应性基因的转录[6]。NF-κB是初级转录因子的一种，具有调节细胞反应的功能，例如细胞中无活性的转录因子，且不需要新的蛋白质合成来激活。这使得NF-κB成为了对有害细胞刺激的第一反应者。已经证明NF-κB在各种炎症细胞因子的激活中起中心作用，且是IBD发病的关键调节剂，因为NF-κB的表达和激活在IBD患者的结肠组织中显著上调。此外，活化的NF-κB的数量与肠道炎症的严重程度密切相关[7]。在IBD中，活化的NF-κB可调节与IBD发生、发展相关的促炎性细胞因子，如TNF-α、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)等的产生和释放，加重肠道的炎性反应[8-9]。TNF-α作为多效细胞因子，通过触发白细胞活化和组织蓄积，在IBD的发病中发挥不可或缺的作用。因此，抑制NF-κB的活化已经作为治疗IBD的抗炎策略。Bortezomib是一种硼酸二肽衍生物，是26S蛋白酶体的选择性抑制药。研究发现，Bortezomib可通过抑制26S蛋白酶的作用抑制IκB的降解，从而阻断NF-κB的活化[10]。目前该药物已应用于多发性骨髓瘤的临床治疗，其安全性和有效性已得到证实。我们实验组在前期的工作中将Bortezomib联合传统化疗药物三氧化二砷用于肝癌治疗的研究，证明Bortezomib可以通过NF-κB的抑制作用增强肿瘤细胞对三氧化二砷的敏感性, 提高肝癌治疗的效果[11-13]。

注：与模型对照组比较，*P<0.05。 图2 结肠HE染色 (400×) A：正常对照组小鼠；B：模型对照组小鼠；C：三种剂量Bortezomib治疗后1 d、3 d和7 d的小鼠；D：三种剂量Bortezomib治疗后1 d、3 d和7 d HE评分Fig 2 HE staining of the colon (400×) A: mice in normal control group; B: mice in the model group; C: mice treated with three doses of Bortezomib for 1, 3 and 7 days; D: HE score in mice treated with three doses of Bortezomib for 1, 3 and 7 days

Bortezomib治疗天数/d注：与模型对照组比较，*P<0.05。图3 Bortezomib治疗后对IBD炎症相关物质TNF-α的影响

注：条带1：正常对照组小鼠；条带2、3、4：PBS处理1 d、3 d、7 d的模型组小鼠；条带5、6、7：低剂量Bortezomib处理1 d、3 d、7 d的小鼠；条带8、9、10：中剂量Bortezomib处理1 d、3 d、7 d的小鼠；条带11、12、13：高剂量Bortezomib处理1 d、3 d、7 d的小鼠。

图4EMSA方法检测NF-κB的DNA结合活性

Fig4DNAbindingactivityofNF-κBinthecolonevaluatedbyEMSA

本研究结果表明，经Bortezomib治疗可以显著下调DSS诱导NF-κB p65核易位水平，且随着用药时间和用药剂量的增加，对NF-κB的抑制作用也逐渐增加，具有明显的时间和剂量依赖性。此外，我们评估了Bortezomib对DSS诱导的IBD小鼠模型的影响。结肠的炎症程度由升高的DAI评分和组织学损伤评分表示。已经证明，应用Bortezomib可以有效减轻结肠炎症。在用日剂量0.6 mg/kg或1 mg/kg的Bortezomib治疗经DSS诱导的IBD小鼠模型3 d或7 d后，DAI评分和组织学评分显著降低，表明Bortezomib可从临床和组织病理学上同时抑制DSS诱导的IBD。而经Bortezomib治疗后，由DSS诱导的结肠炎小鼠模型，TNF-α血清水平显著上调。在应用Bortezomib治疗后，TNF-α的血清水平显著下调，这表明Bortezomib可能通过抑制促炎介质TNF-α来改善IBD的严重程度。

我们的研究结果推测，Bortezomib可能通过抑制NF-κB的DNA结合活性，下调TNF-α的表达水平，减弱小鼠DSS诱导IBD的严重性。从统计数据中可以看出，随着Bortezomib治疗剂量和治疗天数的增加，对NF-κB的活性抑制作用越来越明显，对IBD的治疗作用也越来越来明显。通过将来进一步深入的研究与探索，Bortezomib可能是治疗IBD的新型治疗药物。

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