DNA甲基化调控DACT2在结直肠癌中的表达

张晓梅， 陈海旭， 郭明洲, 杨 超

中国人民解放军总医院 1.消化科；2.老年医学研究所，北京100853;3.中国人民解放军火箭军总医院输血科

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的恶性肿瘤，全球范围内其发病率居恶性肿瘤的第2～3位[1]。在我国，随着居民饮食结构的改变，CRC的发病率呈逐年上升趋势[2]。虽然消化内镜技术的发展促进了CRC癌前病变筛查和早期治疗，但CRC的防治仍有较多不容乐观的方面，如：在一些筛查体系比较完善的国家，CRC的发病率仍呈增长趋势，CRC的癌前病变——腺瘤性息肉，经内镜摘除后仍有较高的再发生率。因此，研究CRC相关的分子、细胞事件依然是目前肿瘤防治工作的基本问题。启动子区高甲基化是常见的抑癌基因灭活的机制之一。表观遗传学研究不但有助于理解肿瘤发生机制，也是探索肿瘤诊断、预后及化疗敏感性等标志物的有效途径[3]。

DACT2为β-catenin的拮抗分子(Dapper, antagonist of β-catenin, DACT)基因家族成员。研究[4-6]表明，DACT2作为抑癌基因参与了乳腺癌、肝细胞癌、食管鳞癌等肿瘤的发生、发展。DACT2与结肠癌的关系虽已有研究，但侧重于DACT2的功能和机制研究[7-8]。关于DACT2在临床标本中的表达未见报道。本研究重点探讨DACT2在CRC中的表达变化及表达调控机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 组织标本：1例正常结肠黏膜标本和16例进展期CRC标本来源于解放军总医院。正常黏膜标本为结肠镜活检标本。所有肿瘤和癌旁组织均为手术切除后经规范病理学诊断的标本。男12例，女4例，年龄(49.44±8.28)岁。用于DNA提取的标本于离体后-80 ℃冰箱保存，免疫组织化学标本固定于甲醛溶液。

1.1.2 细胞系：本课题选用的细胞系有DLD-1、RKO、SW480、HT-29，均来源于解放军总医院消化科肿瘤表观遗传学实验室。

1.2方法

1.2.1 细胞培养：细胞置于质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度孵箱中培养，每2～3 d更换一次培养基。待细胞生长80%～90%融合时，按照1∶3传代接种于T-25培养瓶中。

1.2.2 细胞5-aza-dc处理：生长状态良好的细胞按照约30%密度分别接种于6孔板中，每种细胞接种2孔。12 h后用RPMI-1640 培养液或终浓度为2 μmol/L 5-aza-dc(Sigma)的RPMI-1640 培养液培养细胞，每24 h换液、96 h后收取细胞RNA。

1.2.3 RNA提取和RT-PCR检测: 使用RNeasy mini kit(Qiagen)提取细胞总RNA。采用Superscript Ⅱ-reverse transcriptase 试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。RT-PCR检测DACT2表达。扩增引物为：5′-GGCTGAGACAACAGGACATCG-3′(forward)和5′-GACCGTCGCTCATCTCGTAAAA-3′(reverse)，扩增35个循环。GAPDH作为参照扩增25个循环，以质量浓度为15 g/L的凝胶电泳检样。

1.2.4 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)：亚硫酸氢钠处理细胞或组织总DNA[9]，MSP引物为：5′-GATTTTAGTTTATTTTGGCGATTTGC-3′(M-forward)；5′-CACATCTCCCGAACAAAATCCCG-3′(M-reverse)；5′-TAGATTTTAGTTTATTTTGGTGATTTGT-3′(U-forward)和5′-TCCACATCTCCCAAACAAAATCCCA-3′ (U-reverse)。25 μl的反应体系包括：100 ng硫化处理DNA，25 pmol引物，100 pmol的 dNTPs，2.5 μl的10 × PCR buffer，1 unit的Taq聚合酶。反应条件为：95 ℃ × 5 min，1个循环；35个循环×(95 ℃ × 30 s，60 ℃ × 30 s，72 ℃ × 30 s)；72 ℃ × 5 min，1个循环。以质量浓度为20 g/L的凝胶电泳检样。

1.2.5 亚硫酸氢盐修饰后测序(Bisulfite sequencing, BSSQ)：硫化处理后的DNA进行PCR扩增，扩增引物为：5′-TGGTTATAGATTTTAGTTTATTTTGG-3′ (forward)，5′-CAACCCCTACAACTCCTACAAC-3′(reverse)。反应条件为：95 ℃×5 min，1个循环；35个循环×(95 ℃×30 s，58 ℃×30 s，72 ℃×40 s)；72 ℃×5 min，1个循环。PCR产物凝胶纯化回收，将回收产物插入到pCR2.1质粒载体的多克隆位点，进行克隆和测序[10](Invitrogen)。

1.2.6 免疫组织化学染色和结果判定：组织标本经甲醛固定后制备成4 μm厚度的切片进行常规染色[4]，兔抗人DACT2多克隆抗体(Prosci)浓度为1∶1 000，二抗山羊抗兔辣根过氧化物酶(北京中杉金桥)浓度为1∶2 000。结果判定：在显微镜下随机取5个视野，根据每个视野中阳性细胞数百分比和染色强弱进行H评分(H score)[11]。阳性细胞数为0，记为0分；阳性细胞数<25%，记为1分；阳性细胞数为25%～50%，记为2分；阳性细胞数为50%～75%，记为3分；阳性细胞数>75%，记为4分。染色强弱分为：0分为阴性，1分为弱阳性，2分为中等强度阳性，3分为强阳性，各组织染色结果为染色阳性细胞数与着色强度两者乘积之和。

1.3统计学分析采用SPSS PASW Statistics 18.0统计软件，定量资料满足正态分布后进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DACT2DNA序列CpG二核苷酸分布情况DACT2基因包含4个外显子，在转录起始位点区域(-120～+340 bp)富含GpG二核苷酸，称为CpG岛(见图1)。

图1 DACT2 基因启动子区CpG岛Fig 1 Distribution of CpG sites in the promoter region of DACT2

2.2DACT2在CRC细胞中的表达

2.2.1 DACT2 mRNA表达检测：应用半定量PCR方法检测DACT2在4株CRC细胞系中的表达。阳性表达的细胞系有：SW480、DLD-1、HT-29，表达缺失的细胞系为RKO(见图2A)。

2.2.2 甲基转移酶抑制剂5-aza-dc对DACT2表达的影响：为了验证DACT2低表达是否与该基因启动子高甲基化有关，本研究在RPMI-1640培养基中加入2 μmol/L 5-aza-dc，培养96 h后，RT-PCR检测基因表达。结果显示，在阴性或弱表达的细胞系RKO、HT-29细胞中，甲基转移酶抑制剂处理后DACT2表达恢复或上调，在DLD-1、SW480细胞中，5-aza-dc处理前后DACT2表达无明显变化 (见图2A)。

2.3细胞系中DACT2启动子甲基化改变

2.3.1 MSP检测细胞系中DACT2启动子甲基化状态：共检测4株CRC细胞系，结果显示，RKO细胞呈完全甲基化，DLD-1、SW480、HT-29呈部分甲基化 (见图2B)。

2.3.2 BSSQ定量分析DACT2甲基化状态：BSSQ定量分析DACT2启动子区CpG二核苷酸甲基化的数量。可见正常结肠黏膜组织中CpG二核苷酸以非甲基化为主，CpG位点甲基化率为2.67%。而RKO细胞系以甲基化为主，CpG位点甲基化率为97.14%(见图2C)。

图2CRC细胞系中DACT2的表达及甲基化改变A：5-aza-dc处理前、后CRC细胞系DACT2 mRNA表达情况；B：MSP检测DACT2甲基化改变；C：BSSQ定量分析启动子区甲基化，实心圆点代表甲基化CpG位点，空心圆点代表非甲基化CpG位点

Fig2ExpressionandDNAmethylationchangesofDACT2inCRCcelllinesA: expression of DACT2 mRNA was analyzed before and after 5-aza-dc treatment in CRC cell lines; B: DNA methylation of DACT2 was analyzed by MSP; C: methylation density within DACT2 promoter region was characterized and validated by BSSQ, open circles denote unmethylated CpG site and filled circles represented methylated CpG site

2.4DACT2在CRC组织中的表达和甲基化改变16例CRC标本均包含癌和癌旁组织，IHC检测组织中DACT2的表达。结果显示：DACT2在正常结肠上皮细胞的胞浆呈高表达，在间质弱表达(见图3A)，CRC标本中，可见纤维组织分隔肿瘤和癌旁组织。与癌旁组织相比，癌组织中DACT2呈不均匀低表达(见图3B～3D)。共11例癌组织中DACT2表达下降。表达下降的比例为68.75%(11/16)。MSP检测16例癌组织中的甲基化改变，9例标本中检测到甲基化频率为56.25%(见图3E～3F)。进一步对比基因表达与甲基化的关系，在11例表达降低的标本中，观察到9例存在甲基化改变，甲基化率为81.82%。比较甲基化和非甲基化两组中DACT2的表达得分，可见在甲基化组表达得分低于非甲基化组，二者差异有统计学意义(P<0.05)(见图3G)。

图3DACT2在CRC标本中的表达和甲基化改变A：DACT2在正常结肠黏膜中的表达(200×)；B：DACT2在CRC组织中的表达(100×)，左侧为癌组织，右侧为癌旁组织；C：癌组织放大图像(200×)；D：癌旁组织放大图像(200×)；E：部分病例癌组织甲基化检测；F：DACT2启动子甲基化和表达的对应关系；G：DNA甲基化与DACT2基因表达的关系

Fig3ExpressionandDNAmethylationchangesofDACT2inCRCtissuesA: expression of DACT2 in normal colon tissue (200×); B: expression of DACT2 in a representative CRC tissue (100×). Left image was tumor tissue, the right image was adjacent non-tumor tissue; C: the enlarged image of tumor tissue (200×); D: the enlarged image of adjacent non-tumor tissue (200×); E: representative MSP results of DACT2 in CRC tissues; F: status of DACT2 hypermethylation and expression in each case; G: correlation between DNA methylation and DACT2 gene expression in CRC

3 讨论

人DACT2 是由KATOH等[12]于2003年利用生物信息学方法发现，表达于胎盘、泌尿生殖系统肿瘤及正常结肠黏膜和CRC组织。在蛋白质结构上，有3个保守结构域：亮氨酸拉链(Leucine Zipper, LZ)结构域，参与蛋白质相互作用；N端和C端分别有一个富含丝氨酸的结构域，包含很多潜在的磷酸化位点，涉及自身的修饰调控等；C末端有一个PDZ结合结构域(Ser/Thr-X-Val)。CHEYETTE、GLOY等[13-14]研究发现,DACT2通过PDZ结合结构域与Dishevelled(Dsh/Dvl)相互作用抑制Wnt/β-catenin信号通路。在斑马鱼中胚层诱导过程中，DACT2促进ALK4/ALK5通过溶酶体途径降解来调节细胞膜表面受体进而调控Nodal/TGF-β信号传导[15]。

DACT2作为抑癌基因参与人类肿瘤的发生、发展,但DACT2在CRC中的表达并不清楚。KATOH等[12]采用芯片方法检测到DACT2在正常结肠黏膜和结肠癌组织中呈阳性表达，但未提及是否存在表达差异。JIANG等[7]检测发现,DACT2在部分结肠癌细胞系中表达缺失，但在临床结肠癌标本中仍呈阳性表达。WANG等[8]检测到DACT2在部分结肠癌细胞系中的表达和生物学功能，发现DACT2通过调控Wnt信号通路在结肠癌中发挥抑癌基因的功能，具有抑制细胞增殖、促进凋亡和抑制细胞迁移的作用，但未检测DACT2在CRC临床标本中的表达。

本研究检测了DACT2在CRC细胞系中的表达，观察到RKO细胞中DACT2表达缺失。IHC检测临床标本中，观察到DACT2在正常结肠黏膜中呈强阳性表达。检测16例配对的临床标本(同一患者的癌和癌旁组织)，癌组织中表达低于癌旁组织的有11例。提示虽然癌组织中DACT2呈阳性表达，但表达强度低于癌旁组织和正常黏膜。

基于前期的研究基础和DACT2的DNA序列分析，我们推测癌与癌旁组织的表达差异可能与启动子高甲基化有关。我们检测了甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理对DACT2表达的影响。结果显示，细胞系RKO、HT-29在5-aza-dc处理后DACT2表达恢复或上调，DLD-1、SW480在处理前后表达无明显改变。提示在RKO、HT-29细胞系中DNA甲基化可能调控了DACT2的表达。进一步采用MSP方法检测上述细胞系DNA的甲基化状态，观察到RKO细胞呈完全甲基化改变，其余3种细胞系中均检测到甲基化和非甲基化条带。可能的原因是一对等位基因中的一个或部分细胞群甲基化改变。进一步的BSSQ方法定量检测CpG岛甲基化数量，可见RKO细胞中甲基化率为97.14%，而正常结肠黏膜甲基化率为2.67%。结合上述细胞株中5-aza-dc处理前后基因的表达变化及DNA甲基化的检测结果，可以认为在RKO、HT-29细胞系中DACT2的表达受DNA甲基化调控。同样，我们观察到CRC中DACT2频繁甲基化的现象。对比分析高甲基化与蛋白表达的对应关系，可见在蛋白表达降低的标本中，甲基化率为81.82%，二者具有相关性。说明CRC中DNA甲基化调控DACT2的表达。另外，我们观察到2例表达下降的组织中未检测到DACT2甲基化现象，提示除DNA甲基化外，还存在其他调控基因表达的机制。

本研究中，DACT2在CRC中的表达较癌旁组织降低，DNA启动子甲基化改变是其表达调控的机制之一。WANG等[8]研究提示，在CRC细胞中过表达DACT2可降低结肠癌裸鼠模型的肺转移发生率，而DACT2甲基化与临床患者的不良预后有关。本研究由于临床样本量少，尚无法验证基因表达、甲基化改变与CRC患者临床特征的关系，有待后续研究。

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