芹菜素对胶质瘤U87细胞的抗增殖作用及其机制研究

贡伟一 程 峰 刘 华 张曙光

江苏大学附属昆山医院神经外科，江苏 苏州 215300

恶性胶质瘤是严重威胁人类健康的颅内最常见的原发性肿瘤之一，易复发，难治愈，迄今没有满意的治疗方法，即使联合手术、放疗和化疗，其中位数生存期也只有诊断后12～14个月，而且在过去的几十年内进展不大[1-3]。芹菜素(apigenin) 是天然存在的一种黄酮类化合物，有多种药理活性，如降血压、镇静、抗菌以及雌激素样作用等[4-5]，近年来发现其对乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤也具有抑制作用[6-7]。但芹菜素对胶质瘤的作用国内外基础研究及临床应用仍然比较少。本实验研究主要探讨芹菜素抗胶质瘤的作用及其机制。

1 材料与方法

1．1材料与试剂人胶质瘤U87细胞购自中国科学院上海细胞研究所。芹菜素购自美国Sigma有限公司。高糖DMEM培养基和胎牛血清购自美国gibco公司。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京碧云天生物科技公司。Bak1 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。BAK1 siRNA购自EnoGene公司。

1．2细胞培养和传染U87细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，每隔1～2 d更换1次培养基，铺瓶率达到70%～80%时，胰酶消化传代。选择指数增长的细胞转染BAK1 siRNA，24 h后更换培养基，流式分析转染效率。

1．3 WST-1实验检测细胞增殖能力细胞经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至每孔加入100 μL 2 000个细胞，种植于96孔板，24 h后，给予0、20、40 μmol/L芹菜素，每组设6个复孔，培养72 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，把96孔板置于摇床上摇动1 min，以充分混匀待检测体系，测定450 nm波长处的吸光度值。

1．4流式细胞仪检测细胞凋亡率0、20、40 μmol/L芹菜素处理U87细胞48 h后，把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤1次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。吸除胰酶细胞消化液，加入收集的细胞培养液把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万～10万重悬的细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 mL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中。最后用流式细胞仪检测。

1．5 Western Blot鉴定40 μmol/L芹菜素处理U87细胞48 h后，用裂解液裂解细胞后提取总蛋白，加入5×上样缓冲液，煮沸后，在预制胶中加入10 μL样品，电泳1.5 h后，切胶转膜，300 mA 电流下4 ℃转膜90 min，37 ℃封闭1 h，Bak1抗体1：1 000稀释后37 ℃孵育1.5 h后，孵育二抗1.5 h。显影液显影，凝胶成像仪成像。

1．6统计学方法实验结果采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据采用单因素方差分析，P<0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2．1芹菜素抑制U87细胞增殖如图1A，U87细胞用20、40 μmol/L芹菜素干预24 h后，细胞增殖能力明显下降，并随着药物浓度和时间的增加，细胞的生长抑制率也明显增加。而U87细胞采用Bak1 siRNA预处理后，芹菜素对U87细胞的抑制能力明显下降(图 1B)。

图1 A：20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的生长抑制率；B：Bak1 siRNA预转染U87细胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的生长抑制率

2．2芹菜素诱导U87细胞凋亡如图 2A，U87细胞用20、40 μmol/L芹菜素干预24 h后，U87细胞出现凋亡，并随着药物浓度和时间的增加，细胞凋亡率也明显增加。而U87细胞采用Bak1 siRNA预处理后，芹菜素诱导U87细胞的凋亡率也明显下降(图 2B)。

图2 A：20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的细胞凋亡率；B：Bak1 siRNA预转染U87细胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的细胞凋亡率

2．3芹菜素抑制Bak1蛋白表达进一步我们利用20、40 μmol/L芹菜素处理U87细胞72 h后，Western Blot检测U87细胞Bak1蛋白的表达。我们研究表明芹菜素可明显抑制U87细胞中Bak1蛋白的表达，并且随着药物浓度的增加，抑制效应更加明显(图3)。

图3 20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞Bak1蛋白的表达的影响 A：凝胶电泳图；B：直方图

3 讨论

芹菜素又称芹黄素，是天然存在的一种黄酮类化合物, 有植物雌激素之称, 广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，其中芹菜中含量最高。目前已经作为药物和保健产品用来控制血压及软化血管的用途。芹菜素的化学名称是4'，5，7-三羟基黄酮，分子式为C15H10O6，分子量为270，不溶于水，易溶于乙醇、二甲基亚砜(DMSO)，具有多种药理活性，如抗菌、降血压、镇静等。但近年来研究发现其对肿瘤也具有一定的抑制作用[8-12]：如抵抗肿瘤的增殖和侵袭能力，抑制血管生成以及促使细胞凋亡等作用。

MAFUVADZE等[13-14]研究表明，芹菜素抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及血管生成能力，并且促使部分肿瘤细胞发生凋亡。KUO等[15-17]研究表明，芹菜素可诱导胃癌细胞发生凋亡，及诱导凋亡的作用呈现药物浓度依赖性，且证实芹菜素诱导胃癌细胞凋亡的机制主要是通过bax/bcl-2-caspase-3、9的线粒体凋亡通路活化实现的。SHUKLA等[18-20]研究发现，芹菜素有效抑制前列腺癌细胞增殖，其发挥作用的机制是诱导前列腺癌细胞细胞周期阻滞于G2/M期，这种抑制作用同样表现出现药物浓度依赖。GAO等[21-23]研究发现，芹菜素能诱导Hep G2人肝癌细胞的分化，有效地降低γ-GT 的活性和AFP 的表达。LEE等[24-26]研究证实芹菜素可通过抑制P34Cdc2 激酶的活性从而抑制SW480、HT-29和Caco2三种结肠癌细胞增殖。

而芹菜素对胶质瘤的基础研及临床应用研究仍然比较少。国内仅杨志英等[27]研究报道芹菜素可通过诱导p21、p53 蛋白表达抑制U251 胶质瘤细胞生长。而国外期刊上，WANG等[28]研究发现，芹菜素可通过上调TNF-α水平，过表达Bid蛋白及下调Bcl-xL蛋白增强Hydroxygenkwanin抗胶质瘤作用。但FENG等[29-30]研究发现，芹菜素对U251胶质瘤干样细胞抗增殖作用效果不明显。本实验研究中我们发现芹菜素具有良好的抗胶质瘤效应，20、40 μmol/L芹菜素即可抑制胶质瘤细胞增殖，并促进部分胶质瘤细胞发生凋亡，实验表明胶质瘤细胞用芹菜素干预后Bak1蛋白表达明显上调，而抑制Bak1蛋白表达后，芹菜素的这种抗胶质瘤作用明显减弱，表明芹菜素抗胶质瘤作用主要依赖于调控Bak1蛋白表达。

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(收稿2017-07-13 修回2017-11-20)