LCZ696对血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌肥厚的作用及其机制

李晓增，赵凯，潘磊，乔香玲，张青青，李欣

(邢台市第三医院，河北邢台054000)

心肌肥厚是心脏在各种刺激下产生的适应性改变。心力衰竭通常是心肌肥厚的终末病变, 严重的心肌肥厚甚至可导致猝死[1]。心肌肥厚形成机制至今尚未研究清楚。信号转导与转录激活因子(STAT)是细胞内一类非受体型酪氨酸激酶蛋白家族，STAT3作为该家族中的重要成员，在胚胎早期发育、肿瘤发生、发展及凋亡等生理病理过程中发挥着重要的作用[2]。国外实验证明，在STAT3高表达的T3-TG小鼠中，心肌呈向心性肥大等病理改变，提示STAT3在心肌细胞肥大中起重要作用[3]。LCZ696作为第一个在临床试验获得成功的AR-NI类药物，在抑制血管紧张素受体的同时，能够加强内源性脑钠肽的血管舒张作用[4]。然而其对心肌肥厚的作用尚未明确。本实验于2016年10月～2017年7月，探讨了LCZ696对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌肥厚的作用及其与STAT3通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 野生型C57BL/6小鼠(10～12周)60只，购自北京唯尚立德公司生物科技有限公司。人AngⅡ醋酸盐(Sigma公司生产)；植入式微渗透泵2004(ALZET)泵(美国通用医疗器械公司生产)；乙醚(分析纯，广州试剂厂)；LCZ696(诺华制药)；AG490(北京大科为生物技术公司);masson三色染色液(北京索莱宝科技有限公司)；STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、tublin抗体(Santa Cruz,美国)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)。HPSSOO型超声诊断仪;压力换能器(上海益联医学仪器发展有限公司)；佳能EOS1200D单反照相机；Li-COR荧光扫膜仪(美国Li-COR有限公司)；Accurl C6流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 动物分组及其处理 将动物采用完全随机法分为A、B、C、D组，每组15只。①A组：持续给C57BL/6小鼠吸入乙醚，无菌条件下皮下埋植仅灌注有生理盐水的ALZET泵，并用缝合线缝合切口；②B组：在无菌条件下称取AngⅡ(以1 000 ng/kg/min连续28 d的剂量计算)，并溶于200 μL的0．9%生理盐水，取出微渗透泵，将AngⅡ注入ALZET泵中，无菌条件下将含AngⅡ的ALZET泵埋入皮下，用缝合线缝合切口；③C组：皮下埋入含AngⅡ的ALZET泵的方法同B组，术后1周接受LCZ696(50 mg/kg)治疗4次；④D组：皮下埋入含AngⅡ的ALZET泵的方法同B组，术前3 h注射AG490(4 μg/g)1次。待小鼠清醒后，洁净条件下喂养28 d。

1.3 心功能检测 小鼠术后28 d时，行超声心动图检测,小鼠持续吸入乙醚进行麻醉，胸部备皮。使用超声仪，将频率为5 MHz的超声探头置于小鼠左胸进行测量。检测指标包括左室后壁舒张末厚度(LVPWD)、舒张早晚期的最大血流速度比值(E/A)、左心室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)。

1.4 血流动力学检测 麻醉小鼠仰卧固定后取颈前正中切口，小心分离小鼠右侧颈总动脉，行小鼠左心室动脉插管，通过压力换能器采集监测各组小鼠动脉收缩压(SBP)、动脉舒张压(DBP)。

1.5 检测标本制备 称取小鼠体质量。颈椎脱臼法处死小鼠，取心脏, 冰冻PBS清洗,称取小鼠心脏质量，计算心/体质量、心质量/胫骨长度比值，拍摄心脏大体图片,取部分心肌组织留作凋亡检测,切取部分心肌组织，甲醛浸泡24 h，做病理切片，行Masson染色，应用ImagePro Plus(IPP)分析软件于显微镜下观察心肌病理改变。剩余部分立即液氮冷冻, -80 ℃保存。

1.6 STAT3及p-STAT3蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取各组小鼠心肌细胞总蛋白，通过10%SDS-PAGE行蛋白凝胶电泳，待蛋白完全分离后，将蛋白以80 V恒定电压转至硝纤膜上，室温下用封闭液(1‰Tween20+50 mL 5%BSA)摇动封闭1 h,加入一抗，4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后加入二抗，室温孵育1 h,TBST洗涤后采用Li-COR荧光扫膜仪避光扫描,显像后使用Photoshop分析条带灰度值。

1.7 心肌凋亡检测 充分研磨心肌组织后，用1 mL PBS冲悬细胞并计数(保证细胞数量不少于105)，1 000 r/min离心5 min，收集细胞,加入400 μL 1×Binding Buffer 轻轻冲悬细胞；加入5 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min,加入10 μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 min,在30 min内进行流式细胞仪检测，设定AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

2 结果

2.1 各组心功能、血流动力学、心/体质量、心质量/胫骨长度比较 见表1。

表1 各组心功能、血流动力学、心/体质量、心质量/胫骨长度比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

2.2 各组心脏大体图 与A组比较，B组心脏体积增大，C、D组较B组心脏体积缩小。见图1。

图1 各组心脏大体图

2.3 各组心肌组织病理改变 A组可见少量胶原纤维,散在分布于心肌细胞间隙，B组心肌胶原纤维较A组明显增加，C、D组心肌胶原纤维较B组明显减少。

2.4 各组心肌p-STAT3及STAT3蛋白表达比较 A、B、C、D组p-STAT3蛋白表达灰度值分别为44.75±2.14、107.48±8.77、78.20±4.68、46.25±1.46，STAT3蛋白表达灰度值分别为85.46±1.68、87.13±3.08、94.45±2.55、100.86±4.37。与A组相比，B组p-STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与B组相比，C、D组p-STAT3蛋白表达水平明显降低(P均<0.05)。各组STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.5 各组心肌细胞凋亡率比较 A、B、C、D组心肌细胞凋亡率分别为2.47%±0.22%、17.04%±4.89%、9.77%±2.11%、11.38%±3.05%。与A组相比，B组心肌细胞凋亡率增加(P<0.05)；与B组相比，C、D组心肌细胞凋亡率减少(P均<0.05)。

3 讨论

LCZ696是一种全新研制的药物，化学结构中包含缬沙坦和脑咖啡肽抑制剂前体AHU377两种组分。前者为血管紧张素受体阻滞剂类药物，其比血管紧张素转化酶抑制剂更安全,可阻断AngⅡ介导的各种不良作用，在临床上常用于心力衰竭等疾病的治疗[5]；后者为脑啡肽酶抑制剂，其参与了各种内源性血管活性多肽的分解，包括血管紧张素、缓激肽、A、B、C型脑钠肽等。有研究表明，通过抑制脑啡肽酶活性可影响小鼠血流动力学[6]。LCZ696通过双重作用机制，在降低心血管病死、心衰住院率等方面有更好的表现[7]。

心肌肥厚是临床上十分常见的疾病，多种心内科疾病(如原发性或继发性高血压、心脏瓣膜病变等)病程中均可呈现心肌肥厚改变。当机体血流动力学过负荷时，心脏机械张力增加[8]，继而激活机体肾素-血管紧张素系统、一氧化氮合成系统等[9]。机械性与神经体液性因素相互作用，共同诱导心肌肥厚的发生。在心肌细胞肥大的过程中，心肌组织局部释放AngⅡ，其可以激活心肌细胞表面应力感受器(包括整合素家族等)，从而将刺激信号传递至心肌细胞核内[10]。心肌肥厚早期可帮助维持正常心功能, 但长期的心肌肥厚会导致心功能降低、心脏体积增大、心肌顺应性降低等不可逆性改变，最终导致心力衰竭[11]。心肌肥厚的病理改变包括心肌细胞肥大、心肌间质细胞增殖、心肌发生纤维化以及心脏细胞外基质改建等。本研究发现，与A组相比， B组E/A、LVEF、FS降低，SBP、DBP增加，心/体质量，心质量/胫骨长度比值增高，心脏体积增大，心肌组织呈心肌肥厚、心肌纤维化病理改变；与B组相比， C组与D组E/A、LVEF、FS增高，SBP、DBP降低，心/体质量，心质量/胫骨长度比值降低，心脏体积缩小，心肌肥厚、心肌纤维化病理改变明显减轻。提示LCZ696抑制了AngⅡ诱导的小鼠心肌肥厚，其机制可能与抑制STAT3蛋白激活有关。

心脏发生机械牵拉，或当心脏压力负荷急性增高时，心肌细胞内STAT3激活[12]；另外在心肌细胞增生、肥大的过程中,肾素-血管紧张素等通过自分泌与旁分泌的形式，与心肌细胞表面细胞因子受体或G蛋白偶联受体结合,受体分子发生二聚化，使得与受体偶联的JAK2激酶相互接近，并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，激酶JAK2催化STAT3蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT3蛋白以二聚体形式进入细胞核内，与靶基因特定的序列结合，从而改变相应基因的转录及蛋白的合成。这些研究均表明，STAT3蛋白通路在心肌肥厚的发生、发展过程中发挥了重要作用。通过本实验印证了这一结论。另外我们发现，LCZ696可抑制由AngⅡ引起的小鼠心肌细胞STAT3蛋白激活，继而可能影响其下游基因的激活以及蛋白的表达。

传统观点认为心肌属于永久性细胞，出生后便不能分裂增殖，一旦遭受破坏，则成为永久性缺失，然而有实验表明，在心脏发育及病理过程中，存在凋亡和增殖两种变化, 二者的动态平衡维持了心脏功能的稳态。本研究发现，LCZ696可抑制心肌细胞的凋亡,这一作用可能对治疗心力衰竭等心脏终末期病变有重要作用。

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