固定化微生物技术在水产养殖环境修复中的应用

文/冯东岳 季相山

养殖水体的环境修复更倾向于采用生物方法，尤其是微生物。微生物修复技术具有费用低、耗时短、不影响养殖功能、不易带入二次污染、不破坏生态平衡等优点，在养殖水体修复中得到广泛应用。

近年来，随着我国水产养殖业的快速发展，高密度集约化养殖模式的迅速普及，虽然带来了较高的养殖效益，却给养殖水体带来了大量的残留饲料和排泄物，导致水体富营养化，养殖环境恶化，对养殖水域的生态平衡造成了严重的破坏，阻碍了水产养殖业的健康发展。党的十九大提出了“乡村振兴”战略，2018年中央一号文件《中共中央、国务院关于实施乡村振兴战略的意见》，对实施乡村振兴战略进行了全面部署，要求提升农业发展质量，推进乡村绿色发展。因此，为推进现代渔业建设，养殖水域环境修复就显得尤为重要，这也是加强水产养殖面源污染，实现渔业绿色发展的重要措施。

一、水产养殖水体修复常用微生物及固定化技术

目前，我国应用于污染水体的常规修复方法包括物理修复法、化学修复法和微生物修复法，其中物理修复和化学修复往往会引入新的物质，而以微生物修复为主的生物修复方式具有良好的生态安全性，越来越受到学者们的关注。微生物修复指利用天然存在的或经过特殊培养的微生物，在可调控环境条件下，通过微生物的降解或生物转化作用，把有毒有害污染物转化为无毒无害物质的环境污染处理技术。与传统的物理修复和化学修复技术相比，微生物修复技术具有费用低、耗时短、不影响养殖功能、不易带入二次污染、不破坏生态平衡等优点，所以在养殖水体修复中得到广泛应用。

（一）固定化微生物技术及优点

固定化微生物技术是指应用物理或化学的手段将游离的微生物定位于限定的空间区域内，并使之成为不悬浮于水中仍保持生物活性、可反复利用的技术方法。该技术起始于1959年，最早应用于大肠杆菌的固定化，而后被广泛应用于工业发酵和废水处理，目前已经形成了较为完备的理论体系和技术方法。与利用非固定化状态的微生物进行生态修复相比，采用固定化载体既为微生物菌体提供了必要的附着和保护的空间，又隔离了菌体与周围环境的直接接触，避免引入微生物进行修复而可能产生的新的生态危害。由此可见，对具有高效降解污染物质能力的微生物进行固定化并制成产品，投加到出现水产养殖污染的水体中，既能实现对污染水体的有效修复，又能避免产生新的生态危害，微生物固定化技术在水体修复中具有重要的应用价值。

微生物水体修复技术传统上采用的是喷洒、混合饲料投喂等，对水体的净化效果不是非常理想，其弊端主要表现在以下几个方面：一是游离微生物对环境的适应能力差，易发生大量死亡；二是游离微生物易随养殖水体的流动而流失；三是游离微生物易被水中高等微生物捕食，数量减少。使用固定化微生物不仅可以克服上述缺点，还有如下优点：固定化颗粒里面微生物的生物量浓度高，能使微生物稳定高效的发挥作用；固定化微生物可以长时间多次利用；固定化微生物抗毒性能和耐受力比游离微生物明显增强。

（二）微生物菌种

被固定化的微生物主要是人为选定的对环境污染物具有特效降解能力的菌种，具有以下特点：一是投加的微生物活性高；二是微生物可快速降解目标污染物；三是在水体环境中不仅能竞争生存，而且可维持相当数量。

1.硝化细菌和反硝化细菌

硝化细菌（Nitrifyingbacteria）属于自养型细菌，由亚硝酸细菌（Nitritebacteria）和硝酸细菌（Nitratebacteria）的生理亚群组成。硝化细菌和反硝化细菌是养殖水体氮转化方面最为有效的微生物。亚硝酸细菌可以完成NH4+-N到NO2

--N的转化，硝酸细菌完成NO2--N到NO3

--N的转化，从而把对水产动物有害的氨态氮和亚硝酸盐氮转化为对水产动物基本无害的硝酸盐氮。

反硝化细菌（Denitrifyingbacteria）是引起反硝化作用的细菌。多为异养、兼性厌氧细菌，如萤光极毛杆菌（Pseudomonasfluorescens）、假单胞菌属（Pseudomonas）和气单胞菌属（Aeromonas）等。它们通过反硝化作用产生氧，再利用产生的氧来氧化有机物质而获得自身生命活动所需的能量。反硝化作用即脱氮作用，是指反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，进而释放出分子态氮或一氧化二氮的过程。

2.光合细菌

光合细菌是地球上最早出现的，具有利用原始光能合成体系的原核生物，在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌总称。光合细菌能以光为能源，在厌氧环境下以水产动物残饵及排泄物为碳源进行不产生氧的光合作用，其增氧机制是通过同化水中有机物，减少有机物的耗氧来实现的。它能有效地将硫化氢等有害物质吸收，作为基础物质转化成生物细胞。因此光合细菌在水产养殖中具有良好的水质调控作用，既能增加水中溶解氧，又可以降解对鱼虾有害的物质，还能调节水体pH在适宜的范围，使其适合水产动物生长。

3.芽孢杆菌

芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，好氧，能产生孢子，是具有耐高温、抗应激性的异养菌。芽孢杆菌具有强力分解有机污物的能力，可分解池底的残饵、粪便等有机物，并可转化成单细胞藻类能利用的有机物；降解氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，促进硅藻、绿藻等优良单细胞藻类生长，营造适宜的养殖水质，保持良好的养殖生态环境。此外，芽孢杆菌为活性微生物，它可以促进水产动物提高免疫功能，增强抵抗力和抗应激力，减少病害的发生。

（三）固定化载体

载体是固定化微生物技术的重要组成部分，它为微生物创造了不易解体的生存环境，所以一个理想的固定化载体应具有以下性能：一是对微生物无毒害，生物滞留量高；二是传质性能好；三是性质稳定，不易被生物降解；四是机械强度高，使用寿命长；五是要求固定化技术操作简单。

常用的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体三种类型。无机载体如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。有机载体还可分为两类：一类是高分子凝胶载体，如琼脂、角叉莱胶和海藻酸钙等；另一类是有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、聚丙烯酸凝胶等。复合载体是由无机载体和有机载体材料结合而成，互补两类材料的性能而开发的载体。

（四）固定化微生物方法

1.包埋法

包埋法是将微生物菌体包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，小分子的底物和产物可以自由出入，而微生物菌体却不会漏出，是目前研究最广泛的固定化方法。包埋法可分为高分子合成包埋法、离子网络包埋法及沉淀包埋法。该方法的优点是技术操作简单，固定过程对微生物细胞的活性影响较小，高分子载体密度较低，易于流动，制备成形的固定化小球机械强度较高。但包埋材料对进出的底物和溶氧的扩散具有阻碍作用，不适用于对大分子污染物的处理，实际应用中常用于小分子污染物的降解。常用的载体材料有天然高分子多糖类的海藻酸钙凝胶和卡拉胶、聚乙烯醇、聚烯酰胺等。天然高分子凝胶对微生物无毒，传质阻力小，但结合强度小；而有机合成高分子凝胶强度高，影响微生物的生物活性，同时传质阻力大。

2.吸附法

吸附法是利用微生物所具有的可吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力，将微生物吸附在附加剂表面的固定化方法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、铅炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化的技术。离子吸附法是利用微生物在解离状态下离子键合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、CM-纤维素等。该方法对微生物无毒性，传质效果好，但由于载体与微生物的结合力较弱，可固定的生物量小，因此反应体系的稳定性较差，不利于长期反复使用，在实际应用中主要用于对大分子污染物的应急修复。

3.包络法

包络法是以人工合成生物相容性较好的聚丙烯酸酯共聚物作为载体，使载体表面成膜，内部可以较好地聚集微生物菌体。该方法克服了包埋法的低传质效率和吸附法的低稳定性。微生物菌体既可在该多孔载体外表面生成机械强度高的生物膜，又可在载体内孔中聚集大量的微生物，增大了微生物的聚集密度，提高了利用效果。

4.共价结合法

共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团以化学共价键相连接，从而固定微生物菌体。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，缺点是限制了微生物的活性，同时反应激烈，固定化技术操作控制复杂，条件要求高。

5.交联法

交联法是通过微生物与具有2 个或2 个以上官能基团的试剂进行反应，使微生物菌体相互连接成网状结构，进而达到固定化微生物目的。这种方法由于网状结构的形成获得了良好的稳定性，在长期的反应体系中菌体不易脱落。但反应过程中共价键的形成对微生物细胞的活性影响较大，与酶蛋白的交联作用可能引起酶的失活，影响使用效果。

二、固定化微生物技术在水产养殖中的应用

固定化微生物技术由于具有高效、稳定和生物浓度大的特点，成为了现代水产养殖水域污染的生物修复重要技术手段，在受污染水体的净化处理方面，已经成为重要的研究热点。研究表明某些净水微生物既能通过氧化、氨化、硝化、反硝化、解磷、硫化及固氮等作用将有害物质转变为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等，同时又能分解池塘底部腐败的沉积物，达到净化水质作用。

在降低氨氮等有害物质浓度方面，为了对富营养化水体进行原位脱氮处理，可以采用固定化微生物技术，使用硝化细菌能有效地去除富营养化水环境中的硝酸盐氮，并部分降解水样中的有机物。在高密度、闭合式鲑鱼养殖池中，利用固定化反硝化细菌，可以有效地去除了养殖废水中的NO3

--N。在降低硫化物方面，使用光合细菌可使池塘底泥中的硫化物含量下降，有机物含量下降，而水体中的溶氧量上升，有效改善了养殖水环境。在固定化载体研究方面，研究表明以碳酸钙为成孔剂和环氧氯丙烷为化学交联剂制备大孔聚乙烯醇载体（CPVAF）对硝化细菌进行包埋，获得了均一的孔径和较高的理化稳定性并使其表面积和扩散系数增大，可以固定更多的菌体，达到更好的固定化效果。

三、固定化微生物存在问题与展望

（一）开发特定生物修复功能微生物资源

应用固定化微生物技术修复养殖水体的核心是选择具有特定生物修复功能的微生物，微生物的特性对养殖水体调控起着至关重要的作用，应能充分利用污染水体中的污染物进行自身增殖，实现污染物的吸附降解，使水体环境得以修复。目前，用于水质修复的微生物种类主要是硝化细菌、芽孢杆菌、光合细菌等。因此，当前有限的菌种资源便成为重要的制约因素，需要投入更多的人力和物力对具有特定功能的微生物进行发掘。首先，确立明确的筛选目的，以特定污染物的降解或特定藻类的抑制作为出发点，进行微生物的定向筛选，获得更多具有生物修复功能的微生物。按照来源来看，用于水产养殖系统的微生物包括土著微生物和外源微生物。研究表明，相较于外源微生物，从养殖系统中分离出来的土著微生物对养殖系统有更好的适应性和高效的去除能力。其次，在菌株的保存上，应对相关特定生物修复功能微生物进行分类，建立专业的菌种库，结合信息技术建立完善的特定菌种数据库，实现菌种的信息化管理，和其他菌种库开展互相交换和补充菌株，充分利用各地资源。

（二）应用高效廉价的固定微生物载体

理想的固定化载体能在生产中大量应用并产生经济效益，要求它必须价廉且高效。目前应用的各种微生物吸附剂制备简单，操作容易，反应条件温和，制备价格低廉，但微生物与载体的结合力较弱、稳定性差，影响处理效果。如沸石和陶粒等价格相对低廉，但固定效果较差，且在自然水体的投加体积相对较大，可能影响到水体自身环境。而常用的高分子包埋载体制备工艺复杂，成本高，因此影响了这类载体的大量使用。如海藻酸钠和壳聚糖等载体固定效果较好，但其加工成本较高，不利于实际应用。总体上目前用于固定微生物的载体种类较少，且生产成本较高，形成大规模产业还有一定差距。因此，提高吸附剂的吸附能力，简化包埋载体的制备工艺，使用和研究新型廉价的适合制备载体的高分子材料，有机高分子材料与无机多孔材料的结合等将是今后的研究热点。同时，需要提高固定化载体的重复使用率，延长使用寿命，降低使用成本。

（三）研究开发新型高效的固定化微生物反应体系

在传统反应器中应用新型固定化微生物技术，无法充分发挥其效用。因此，原有生物反应器的改进以及适合固定化微生物的高效生化反应器的研究，将是一个急需解决的问题。可以根据实际情况，开发出更适合于微生物固定化的高效生化反应器，以此形成从微生物的筛选、驯化、固定化、实际应用的完整系统。目前，生物膜法是国内外的研究热点，该方法主要是依靠固着于载体表面的微生物来去除水体中的有机物、氨氮和亚硝酸氮等，是循环水养殖模式的重要组成部分。从构造物的形式分类，生物膜反应器有4 种形式：生物滤池、生物转盘、流化床和生物接触氧化。

总体上，在我国由于水产养殖业的快速发展，养殖水体的污染程度越来越高，生物修复作为一种重要的手段受到越来越多的关注，这也是渔业绿色发展的必然需求，也是实现乡村振兴战略的重要内容。固定化微生物技术能够高效地使养殖水体净化，通过建立高度净化的废水处理系统，有利于减少或避免养殖废水的排出，降低环境污染，并有利于建立高密度循环式养殖系统，降低生产成本，从而促进养殖业向环境友好、可持续的方向发展。因此，固定化微生物技术在养殖废水处理中的应用前景十分广阔，通过技术方法的研究和不断改进，固定化微生物技术一定能在养殖废水生物处理的实际应用中发挥巨大作用。