杜泊绵羊胚胎移植研究

朝格吉乐图

胚胎移植技术是生物工程领域一项高新技术，该项技术可以最大限度地发挥纯种优秀母畜的繁殖潜力，大大加快良种畜群的繁育速度。为了充分发挥利用从进口杜泊绵羊的优秀遗传基因，解决进口种羊难问题。2016年9月～ 2017 年3月在内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗，对进口杜泊绵羊进行胚胎移植工作，取得了良好效果。表明将胚胎移植技术应用于大规模畜牧生产进入商品化推广阶段是可行的。主要包括：总结、验证应用胚胎移植技术生产杜泊绵羊的最佳时间；研究供体羊同期发情、超数排卵所用激素的合适计量；应用、掌握绵羊子宫角输精的方法，增强超数排卵的效果。

1 研究材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物：选择健康状况良好、膘情适中、正常发情的进口杜泊母羊7只为供体；选择12月龄以上、体格较大、发情正常、膘情适中、母性好、无生殖器官疾病的小尾寒羊100只作受体。

1.1.2 药品：PGF2α（氯前列烯醇）， 丹东生产，.2mL：0.2mg/支；FSH（垂体促滤泡素），冻干粉末，加拿大生产，100 u/瓶；PMSG（注射用血促性素）宁波生产，1000单位/瓶；CIDR（阴道栓），新西。

1.1.3 器械：手术器械3套（手术刀、剪刀、组织镊、止血钳、缝合针、持针钳、手术推车、手术灯、保定架等），生物显微镜，体视显微镜， 电刺激采精仪，水浴锅，恒温箱， ，开膣器，灭菌锅，放栓枪、集精杯、耗材（注射器、医用纱布、脱脂棉、一次性手术帽、一次性手术口罩、一次性乳胶手套、一次性平皿、一次性输液器、喷漆等）。

2 试验方法

2.1 地点：内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗。

2.2 时间：2016年9月9日-2016年10月15日。

2.3 供、受体羊的选择：以杜泊绵羊为供体，选择的标准为健康无病、膘情适中、生殖器官发育良好、发情正常。小尾寒羊为受体，要求12月龄以上、体格较大、发情正常、膘情适中、母性好、无生殖器官疾病，且坚决不能接触公畜。

2.4 供、受体羊的饲养管理：在试验开始前60d组织人员将供、受体羊只单独组群，并加强对供体饲养管理，每只羊每天在自然放牧的基础上饲喂TMR颗粒饲料1 kg，以保证其营养供给。供、受体羊群圈舍需远离公羊舍，以免公羊进入配种。

2.5 公羊的饲养管理：配种前1个月开始调整公羊日粮，将精料中的蛋白质含量提高，并且保证每天每只羊各饲喂1个胡萝卜和1个鸡蛋，配种前2周开始用电刺激采精法对公羊进行采精训练，排出死精，准备配种。

2.6 供体母羊的超数排卵：采用FSH递减法，1批处理，用孕酮阴道海绵栓处理10 d，开始注射FSH，每日间隔12 h，连续3 d。注射FSH的第1针时同时注射PMSG， 注射FSH的第5针时同时注射PG。注射最后一针时撤去CIDR。

2.7 供体母羊的发情鉴定和配种：要经过早、晚两次试情，并记录记录母羊的发情时间。将供体母羊与带有试情布的公羊放于同一面积适当的圈舍，观察试情公羊及供体母羊，当母羊站立不动接受试情公羊爬跨时，肌肉注射LH1mL/只，然后开始用腹腔镜输精的方式进行配种，并记录配种时间和公母羊号，每次輸原精0.2 mL以上，要求精子活力达到0.3以上。

2.8 受体羊的同期发情处理：采用PGF注射法，试剂用量每次1mL/只，间隔9～10 d再注射一次PGF ，12 h后开始用公羊试情，并标记发情羊只，要准确记录发情的时间。

2.9 胚胎的采集、检查和鉴定：供体羊母羊子宫角配种后7d开始收集胚胎。供体羊手术前需空腹24h，将其绑缚于手术架后对手术部位剪毛消毒，麻醉，开始手术。在乳房前2 cm腹中线两侧切口，长度为2～3 cm。将食指和中指伸入腹腔内引出子宫角和输卵管。用18#～20#针头在子宫角基部扎一小孔，将Fr 8-10冲卵管导入子宫角内给冲卵管气囊充气2～5mL，拔出冲卵管内芯，然后在宫管结合部将6#～8#针头导入子宫角内，用40mL注射器抽取冲卵液与头皮针连接进行子宫冲胚。回收液用φ120 mm表面皿接收。供体母羊创口采用两层缝合法，即腹膜与肌肉进行连续缝合，皮肤进行结节缝合。缝合皮肤前给皮下撒适量的青霉素，并肌注青霉素。注意：在整个手术冲胚移植过程中，不暴露卵巢，只是将输卵管和伞部轻轻地导出，同时轻轻向上提，即可检查左右侧黄体情况。

胚胎收集以后放在显微镜下进行胚胎等级鉴定。A级胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调透明度良好，无附着的细胞和液泡或很少；B级轮廓清晰，色调和细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞占10%～30%；C级轮廓不清晰，色调发暗，结构松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞超过30%，但仍有一团细胞存活；D级胚胎变性细胞占75%左右，无组织结构。其中A、B、C等级的胚胎可用于移植，D级不可用。确定胚胎可用后，把胚胎移入含有新鲜PBS的小检卵杯中准备短期内移植。

2.10 胚胎移植：与供体羊相同，受体羊手术前需空腹24h，将其绑缚于手术架后对手术部位剪毛消毒，麻醉，开始手术。将受体羊腹腔切开一个2～3cm的小口子，食指和中指伸入腹腔，引出子宫角，并用手感觉黄体，发现有黄体后给该侧子宫角移植胚胎， 子宫角两侧如都有黄体的可在两侧同时移植，两侧都无黄体的不移植，缝合创口即可。缝合皮肤前需要撒适量的青霉素，术后需要给每只羊肌注一定量的青霉素。

2.11 术后处理：手术两天后要密切观察供、受体羊的状态，防止意外不良情况的产生。术后7 d供体羊需注射PG用以消除黄体。并继续观察受体羊的发情状况，对第2情期后未返情的受体羊需要加强饲养管理，防止流产；对返情羊需从受体羊群中分离，并对其继续配种。

3 研究结果

3.1 供体羊人工授精及胚胎获得结果

腹腔镜输精技术是家畜品种改良工作中的一项新的繁育技术，在肉羊胚胎移植技术使用过程中，虽使用技术较为复杂，但与经阴道进入子宫颈输精相比具有受胎率高的显著特点，因而在目前胚胎移植技术中被广泛使用。本次研究采用腹腔镜输精技术使7只供体杜泊母羊全部受孕，并成功获得胚胎。7只供体共获得胚胎58枚，胚胎合格率为86%。

3.2 受体羊同期发情效果

同期发情技术就是利用激素制剂调整母畜的发情周期，使其在相对集中的时间内发情。利用该技术可将受体羊的发情调整到一定时间内同时进行，使供、受体羊的发情时间同步，为胚胎移植到受体后继续发育创造必要的条件。本研究共用同期发情方法处理100只受体母羊，其中88只表现发情，发情率为88%。

3.3 受体羊妊娠及产羔结果

在接受胚胎移植的49只受体中，有35只受体被确认为妊娠，妊娠率为71.4%，产下黑头杜泊羔羊35只。

4 杜泊绵羊胚胎移植研究讨论

4.1 杜泊綿羊胚胎移植效益

以杜泊绵羊作供体，小尾寒羊做受体，利用胚胎移植技术，可充分发掘杜泊绵羊种羊的繁殖力潜力，在不影响供、受体母羊以后繁殖性能的前提下，每只母羊每年可多产4只纯种羊，比自然繁殖率提高了3倍以上，每只杜泊种羊可多创造2万元的经济效益。

4.2 胚胎移植技术效果分析

4.2.1 胚胎移植时间合适

本次试验研究选取在文献介绍胚胎移植成功率较高的秋季进行，小尾寒羊母羊受体的妊娠率达到71.4%，与吴晓东等用小尾寒羊移植杜泊供体试验妊娠率的53.8%结果高出32.7%，高与昭通绵羊秋季试验妊娠率68.6%结果。表明小尾寒羊在秋季移植的妊娠率要高于春季。

4.2.2 注重对受、供体母羊及公羊管理

对供体母羊科学管理的程度决定了提供胚胎的质量，而受体母羊的管理水平则关系到胚胎移植后妊娠率的高低，因此胚胎移植前期对供、受体母羊及其公羊进行了精心的饲养管理。胚胎移植手术完成以后，及时的对受体羊返情情况进行了认真细致的观察，并将妊娠成功的母羊单独组群，并进行精细管理，在妊娠后期加强了补饲，临产前加强管理，对难产吗、母羊予以人工辅助生产，从而保证了较高的产羔成活率；种公羊在注重营养保证精子质量的同时，要适时进行采精训练，使其性欲和精液品质在配种时达到最佳。

4.2.3 其他说明

本次试验采用内窥镜输精法对供体种羊进行输精，这种方法与阴道输精法相比受胎率显著的增加，从而保证了超数排卵的数量较高与质量较好。

作者单位：内蒙古巴彦淖尔市家畜改良工作站