肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化TGF-β1/Smad信号通路的影响

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肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson病(Wilson disease，WD)，是一种以进行性铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传疾病，临床表现为锥体外系症状、角膜色素环、肝硬化及肾功能损害等[1]。由于铜离子在体内沉积的速度、部位和程度不同，临床表现具有多样性，但无论是脑型、肝型还是其他类型，肝纤维化几乎是每一个WD病人肝脏的主要病理改变[2]。肝纤维化是发展成肝硬化的必经阶段，肝硬化以及在其基础上的合并症是WD病人死亡的最主要原因，抗纤维化治疗可以阻止乃至逆转肝纤维化进展[3-4]。

研究表明，目前临床所用西药对WD所致的肝纤维化多无逆转作用，且常用的金属络合剂如青霉胺等长期应用后安全性差，不良反应多。而传统中药治疗WD疗效显著，不良反应小，安全性高。肝豆扶木汤(gandoufumutang，GDFMT)是我科治疗WD肝纤维化的效方，临床疗效显著[5]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是促进肝纤维化发展重要的细胞因子之一[6-7]。本研究采用肝豆扶木汤治疗WD肝纤维化动物模型——TX小鼠，观察其肝纤维化血清指标及肝组织TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表达，探讨肝豆扶木汤治疗WD肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 TX小鼠种鼠从美国 Jackson 实验动物中心引进，饲养于安徽中医药大学教育部重点实验室动物房，SPF级，并进行传代繁殖。以基因检测结果选取子代雄性TX小鼠24只，正常对照组DL小鼠8只。

肝豆扶木汤(由何首乌、三七、郁金、白芍、枸杞、土茯苓、柴胡等中药组成)，由安徽中医药大学第一附属医院提供，每剂生药重156 g；青霉胺，规格每片0.125 g，购于上海医药集团有限公司信谊制药总厂，批号：H31022286。

1.2 主要仪器与试剂 透明质酸(HA，南京森贝生物)，层粘连蛋白(LN，上海酶联生物)，Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ，伊莱特生物)，Ⅳ型胶原(C-Ⅳ，上海古朵生物)，TGF-β1和Smad7(北京博奥森生物)，Smad2(美国Bioworld)，JW3021HR型离心机(安徽嘉文)，ZT-12M型自动脱水机(湖北孝感亚光)，YB-7B型石蜡包埋机(湖北孝感亚光)，RM2135型切片机(德国Leica)，科力飞QP-B型切片漂烘仪(合肥电子科学研究所)，HEAL FORCE NW 10UF型纯水仪(香港力康生物)，88-1型搅拌器(常州国华)，JD801型生物显微摄像系统(江苏省捷达)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 24只TX小鼠随机分为模型组、青霉胺组、GDFMT组，每组8只，正常对照组DL小鼠8只。

1.3.2 给药方法 青霉胺组研成粉剂，用蒸馏水配成混悬液按0.1 g/kg (按70 kg体重成人日用量的9倍计算)灌胃；GDFMT组按20.1 g/kg(按70 kg体重成人日用量的9倍计算)灌胃，正常对照组和模型组均用等量生理盐水灌胃，每组每天灌胃1次，连续28 d。

1.3.3 标本采集 灌胃4周结束后用3.3%的水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉处死小鼠，腹主动脉取血，离心提取血清，剪取肝脏，制备石蜡切片，组织切片厚度4 μm ，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，一抗4 ℃孵育，聚合物增强剂室温孵育15 min～20 min，辣根酶标记聚合物室温孵育15 min～20 min，DAB显色，苏木素复染，封片，镜下观察。

1.3.4 肝纤维化血清学指标 按照试剂盒的操作步骤进行竞争性放免分析法检测血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量。

1.3.5 肝组织TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表达 采用免疫组化法检测肝组织TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白的表达。

2 结 果

2.1 GDFMT对小鼠血清肝纤维化指标的影响 与正常对照组比较，模型组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，青霉胺组和GDFMT组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05或P<0.01)；与青霉胺组比较，GDFMT组血清肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05)。详见表1。

2.2 GDFMT对小鼠肝组织TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组TGF-β1和Smad2蛋白表达明显升高(P<0.01)，Smad7蛋白表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，青霉胺组和GDFMT组TGF-β1和Smad2蛋白表达明显降低(P<0.01)，Smad7蛋白表达明显升高(P<0.01)；与青霉胺组比较，GDFMT组TGF-β1和Smad2蛋白表达均明显降低(P<0.05)，Smad7蛋白表达明显升高(P<0.05)。详见表2，图1～图3。

组别nTGF⁃β1 Smad2 Smad7正常对照组80．40±0．030．44±0．011．13±0．05模型组81．17±0．071)1．24±0．101)0．42±0．061)GDFMT组80．68±0．022)3)0．74±0．052)3)0．84±0．032)3)青霉胺组80．76±0．012)0．81±0．042)0．72±0．042) 与正常对照组比较，1)P<0．01；与模型组比较，2)P<0．01；与青霉胺组比较，3)P<0．05。

注：A代表正常对照组；B代表模型组；C代表GDFMT组；D代表青霉胺组。

注：A代表正常对照组；B代表模型组；C代表GDFMT组；D代表青霉胺组。

注：A代表正常对照组；B代表模型组；C代表GDFM组；D代表青霉胺组。

3 讨 论

WD是常染色体隐性遗传的单基因疾病，主要导致铜代谢障碍，促使体内铜离子沉积，影响肝、大脑、肾等脏器结构及功能，肝脏是铜代谢的枢纽器官，铜离子沉积常导致肝纤维化，甚至肝硬化等[1]。中医无肝豆状核变性一词，根据其临床表现，多归属“肝风”“积聚”“癥瘕”等病证范畴。先前临床研究表明，WD肝纤维化多是由于肝肾亏虚、痰瘀互结所致，采用补益肝肾、袪痰化瘀法，创制GDFMT，正是针对WD肝纤维化肝肾亏虚，痰瘀互结病机而设的组方。本方由何首乌、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金及柴胡等药组成。其中何首乌、枸杞补益肝肾、扶正固本；三七、郁金、土茯苓活血化瘀、解毒除湿；白芍、柴胡柔肝敛阴、调达肝气，诸药合用，共奏补益肝肾、豁痰化瘀之功效。现代药理研究表明，何首乌中所含的二苯乙烯苷对肝脏具有保护作用[8]。枸杞多糖可以通过阻止内质网的损伤，促进蛋白质合成及解毒，有助于损伤肝细胞的恢复及再生[9]。三七总皂苷能抑制肝脏胶原纤维合成与沉积，具有抗肝纤维化作用[10]。柴胡皂苷是柴胡属植物中主要的有效成分，具有保肝作用，与传统中医记载的柴胡疏肝解郁功效一致[11]。郁金挥发油可以改善肝功能，促进肝细胞再生[12]。白芍总苷为白芍的有效部位，具有抗急性肝损伤、非酒精性脂肪肝、慢性肝纤维化及抗肝癌等多种作用[13]。WD纤维化是由于铜离子沉积导致的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，其本质是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡[14-15]。WD是一种遗传性铜代谢障碍疾病，铜离子在肝脏内沉积，通过氧化应激作用刺激肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖[16]，HSC是肝纤维化发展中的一个重要事件，因为它是ECM产生的主要细胞来源[17]。

TGF-β1是促进肝纤维化发展的关键因子，它可以激活HSC并促进其表达ECM。Smad蛋白是TGF-β信号转导过程中重要的胞内信号分子。Smad蛋白有8种，根据功能不同分为3类：受体调节型Smad (R-Smad)，有Smad1，2，3，5，8；通用型Smad(Co-Smad)，有Smad4；抑制型Smad(I-Smad)，有Smad6，7[18]。TGF-β1与HSC膜表面的Ⅰ型、Ⅱ型受体结合后磷酸化激活Smad2，3，活化的Smad2，3与胞质中的Smad4结合形成复合物进入细胞核内，在核内调节目标基因的转录[19]。磷酸化的Smad2，Smad3诱导Tβ1R/Smad复合物形成，促使HSC活化为成纤维细胞(myofibroblaster，MFB)，激活的HSC通过分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)及其抑制物(inhibitors of metalloproteinases，IMP)，抑制ECM降解，诱导肝纤维化的发生[20-21]。Smad7是负性调控因子，它可以抑制HSC的转化和ECM的合成与分泌[22]。基于TGF-β1/Smad信号转导通路在肝纤维化发展过程中的重要意义，用药物干预该信号通路可以为防治肝纤维化提供新的方法[23]。

TX小鼠是由同系繁殖到F68的DL小鼠所产生的自然突变品系，其致病基因与WD致病基因——ATP7B基因的同源性达82%，能较好地模拟WD临床征象，是理想的WD模型动物。本研究采用TX小鼠作为研究对象，通过肝纤维化TGF-β1/Smad信号通路来观察中药GDFMT对其的影响，结果表明，GDFMT能有效地降低TX小鼠肝纤维化血清指标从而发挥抗纤维化的作用，其作用机制可能是GDFMT抑制TGF-β1和Smad2蛋白的表达，上调Smad7蛋白的表达。表明GDFMT可以通过TGF-β1/Smad信号转导通路抑制肝纤维化的发生与发展。

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