一株中华鳖气单胞菌噬菌体的分离及功能鉴定

吕孙建， 刘 莉， 曹 铮， 卢淑娟， 林 锋

(农业部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室/浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313001)

中华鳖(Trionyxsinensis)，肉质鲜美，具有较高的营养及药用价值，是东南亚国家的主要淡水水产养殖动物，在我国、日本等地区均有养殖，我国的中华鳖产量一直居世界产量之首[1-3]。近年来，高密度养殖导致的药物滥用及养殖水质恶化等原因引起中华鳖疾病(细菌病及病毒病等)频发[4]，其中嗜水气单胞菌等细菌性病害最为常见，目前已知的中华鳖细菌性病害包括红脖子病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[5]。

嗜水气单胞菌是水产养殖中最为常见的条件致病菌，在大部分水产养殖水体中均能检测到该细菌。该细菌为多致病因素病原菌，具有较强的毒性，能够释放毒素(细胞毒性和细胞紧张性刺激物)、内毒素(脂多糖)、蛋白酶、溶血素、肠毒素和各种酶。此外，这些毒力因子释放还会引起宿主感染加重，从而加重疾病的爆发[2]。

目前，中华鳖细菌性病害常用抗生素药物进行预防和治疗，但是抗生素药物的大量使用产生了一系列严重的问题，如病原菌产生抗药性、养殖水质恶化和药物残留等[4]。近些年，这些药物的选用主要是套用鱼类用药的使用标准，效果往往不理想，且抗生素的使用正在逐步禁止及规范[6]，目前亟须研发一种新型、有效且环保的治疗制剂对中华鳖的疾病进行有效预防及治疗。

噬菌体(bacteriophage)是寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等中的一类病毒，亦称细菌病毒[7-8]。噬菌体以细菌作为宿主，可以特异性地杀灭相应的宿主菌，因此噬菌体是一种很有潜力的新型治疗制剂。目前，噬菌体的研究已经涉及医药、农业、食品加工、废水处理等行业，并获得了可喜的成果，其中不乏在水产养殖应用的成功案例[9-10]。李新宇等研究报道，国内外关于噬菌体疗法在水产养殖中的应用研究结果表明，噬菌体可有效控制水体中的病原菌，包括副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、嗜环弧菌(Vibriocyclitrophicus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等，适用范围广[11]。

本研究从中华鳖的养殖水体中分离气单胞菌噬菌体1株，并通过电镜观察、序列测定及噬菌效果观察研究其生物学特性及其对细菌的裂解作用，为今后利用该噬菌体作为替代抗生素的生物防控技术提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中华鳖 试验用发病中华鳖大小为100～200 g，试验前暂养7 d(暂养期间投喂甲鱼饲料)，挑选裙边有明显溃烂的中华鳖用于试验。

1.1.2 菌株 试验所用嗜水气单胞菌分离自中华鳖养殖池，副溶血性弧菌分离自南美白对虾养殖池。试验用细菌均保存于浙江省淡水水产研究所。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离及鉴定

1.2.1.1 噬菌体的分离 嗜水气单胞菌噬菌体的分离使用胰蛋白胨大豆琼脂培养基，以中华鳖养殖塘中分离出的嗜水气单胞菌为宿主菌，采用双层平板分离法分离裂解性噬菌体。噬菌体出斑后挑斑用液体胰蛋白大豆琼脂胨培养，重复以上过程直至纯化。

1.2.1.2 噬菌体的电镜观察 采用磷钨酸负染法。为了获得背景清晰的图片，应浓缩和净化噬菌体浓缩液。通常采用超速离心的方法沉降噬菌体颗粒。将增殖液经过4 ℃、8 000 r/min 离心30 min，取上清液，再通过10 000g的离心力超速离心使噬菌体颗粒沉降，用适量的PBS缓冲液洗涤沉淀。

1.2.1.3 噬菌体的序列测定 采用随机引物扩增法获得噬菌体的部分片段序列。具体步骤是取中华鳖养殖池塘水，12 000 r/min 离心20 min；取上清液0.22 μm过滤，提取滤液DNA。以该DNA为模板，94 ℃变性3 min，冰上冷却 2 min，加入0.5 μL 3′-5′ exo-Klenow DNA Polymerase后置于 37 ℃ 水浴1 h，重复1次变性、退火及延伸过程，将DNA补平。双链DNA补平反应体系为10×Klenow Buffer 3 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，FR26RV-N引物(GCCGGAGCTCTGCA GATATCNNNNNN)2 μL，DNA模板3 μg，3′-5′exo-Klenow DNA Polymerase总用量1 μL，加水补足反应总体系达30 μL，反应产物作为后续扩增模板。

上述合成的双链cDNA和补平的双链DNA应用FR20 RV(GCCGGAGCTCTGCAGATATC)单引物进行随机PCR扩增，取5 μL PCR产物经琼脂糖电泳检测后，其产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。

PCR扩增产物经纯化后，用限制性内切酶EcoRV将引物切除。酶切反应体系为25 μL，其中纯化的PCR产物20 μL，EcoRV 2.5 μL，Buffer 2.5 μL。反应条件为37 ℃，作用时间 3 h。酶切产物在1%琼脂糖凝胶的条件下进行琼脂糖凝胶电泳，切取DNA大小范围在600～1 500 bp的凝胶回收目的片段。

将回收的DNA片段和pSIMPLE 18 EcoRV/BAP Vector(Takara)连接并转化，挑取单克隆进行PCR鉴定，筛选 500 bp 以上片段大小不等的96个阳性克隆进行测序。测得的序列拼接后去除载体序列，并在NCBI数据库中应用Blastn工具进行核苷酸序列比对。

1.2.2 噬菌体应用效果评估

1.2.2.1 噬菌体对细菌的裂解效果 采用双层平板法和滴注法观察噬菌体的噬菌效果。双层平板法：首先配制2% LB琼脂培养基和0.7%半固体LB培养基，将融化后的2% LB培养基倾注培养皿底层，凝固后为底层培养基，将0.7%半固体培养基融化后于42 ℃保温，再将一定量的噬菌体分别与嗜水气单胞菌和副溶血弧菌混合，吸附20～30 min后，与半固体培养基混合，倾注在底层培养基上，28 ℃培养6～8 h后，观察噬菌斑。滴注法：首先用涂布法将宿主菌涂满整个平板，待平板表面风干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌体液，28 ℃培养8～12 h后，观察噬菌效果。

1.2.2.2 噬菌体对中华鳖腐皮病的治疗 培养新鲜气单胞菌菌液至D550 nm为0.25，加入MgCl2使之终浓度达4 mmol/L，静置吸附20～30 min，摇5 h后收获。将培养液移入离心管中，以10 000 r/min离心10 min，以沉淀寄主细菌；将上清液移至新管中，以0.22 μm孔径的过滤器去除残余菌体，即得不含寄主细菌的噬菌体原液，采用双层平板法测定其效价。将已患腐皮病中华鳖(100～200 g)放入水中，每4 L水中泼洒1×109噬菌体液10 mL，1次/2 d，5～7 d后观察中华鳖。

2 结果与分析

2.1 噬菌体序列分析

本研究利用随机引物扩增方法得到随机片段92段，其中与其他细菌同源或未知的序列72段，与噬菌体同源的序列20段。与噬菌体同源的20段部分序列的比对结果均显示与气单胞菌噬菌体有较高同源性，核酸片段序列最低相似度(NCBI BlastN identity score)为61%，最高相似度达到95%。表1列举了相似度最高的4段片段的测序结果。表1、图1显示，前2段序列与气单胞菌噬菌体Aes012的序列极为相似，第3段与4段分别与气单胞菌噬菌体Aes508和31极为相似。

2.2 噬菌体电镜观察

本研究通过电子显微镜观察噬菌体，并结合《病毒分类——国际病毒分类委员会第9次报告》，发现从甲鱼养殖水体中分离得到的噬菌体为尾噬菌体目肌尾噬菌体科噬菌体。图2中黄色箭头所指的为噬菌体。该噬菌体头部呈廿面体，为60～145 nm，并伴有长短不一的尾巴(80～455 nm)。

2.3 噬菌体对细菌的裂解效果

本试验采用双层平板法及滴注法检测该噬菌体对嗜水气单胞菌及副溶血弧菌的裂解效果，图3-A为双层平板法培养的嗜水气单胞菌添加噬菌体6 h后的结果，图3-B和图 3-C 分别为嗜水气单胞菌和副溶血弧菌滴加噬菌体 8 h 后的结果。图中可见明显的噬菌斑，说明该噬菌体对这2类细菌均有较好的裂解效果。

表1 气单胞菌噬菌体部分片段的序列

2.4 噬菌体对中华鳖腐皮病的治疗

用重新培养的噬菌体治疗患腐皮病裙边溃烂的中华鳖，经5 d连续治疗后，鳖裙边的腐烂创口开始结痂并脱落，伤口逐渐愈合，说明该噬菌体对中华鳖的腐皮病有较好的治疗效果。

3 讨论

本研究成功从中华鳖养殖塘中分离得到噬菌体1株，经过序列比对确定为气单胞菌噬菌体，且为肌尾噬菌体科。目前，已从养殖用水中分离得到多株肌尾噬菌体并成功应用于水产动物病害防控，Jun等分离得到2株肌尾噬菌体(pAh1-C和pAh6-C)并用于泥鳅细菌病的防控，Silva等分离得到1株肌尾噬菌体(Phage AS-A)并用于塞内加尔鳎细菌病的防控[12-13]。

噬菌体作为细菌的天敌，具有特异性强、见效快、无毒害、无污染的特点，受到人们的高度关注，并已成功应用于农业、畜牧业、水产养殖业以及食品加工储藏等领域[9]。已有研究发现，噬菌体在水产动物疾病防控中能够有效控制多种致病菌，例如副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、哈维弧菌、变形假单胞菌等。Mateus等发现3种可特异性裂解副溶血弧菌的噬菌体(VP-1，VP-2和VP-3)，并发现2～3种噬菌体混合使用，对弧菌的抑制效果优于单独使用[14]；胡蝶等制备副溶血弧菌噬菌体微胶囊，并与饲料一起投喂方斑东风螺(Babyloniaareolata)，发现东风螺肠道宿主菌平均比对照组减少96%，水体中宿主菌减少72%[15]；王志丽、Jun等分别从中华鳖及汉河中分离得到噬菌体，对嗜水气单胞菌有明显的裂解作用[12，16]。

本研究分离得到的气单胞菌噬菌体对多种病原菌具有良好的裂解作用，通过双层平板法和滴注法发现该噬菌体能够有效抑制副溶血弧菌和嗜水气单胞菌，并形成明显的噬菌圈。通过动物试验发现该噬菌体对中华鳖的腐皮病具有良好的治疗效果，水体添加噬菌体液后，发病甲鱼体表溃烂部位明显结痂脱落并愈合。在其他研究中，同样发现噬菌体能够有效抑制水产动物病原。哈维弧菌和黄海希瓦式菌是引起水产鱼类、虾、刺参等动物腐皮病的主要病原，Karunasagar等通过对哈维弧菌感染的对虾注射2株不同的噬菌体，对虾存活率分别为88%和86%，明显高于注射抗生素的对虾[17]；李新宇等证明噬菌体可有效抑制黄海希瓦式菌，显著提高刺参的存活率[18]。此外，目前已报道的噬菌体多对单一细菌有抑菌作用，本次分离的噬菌体具有广谱的抑菌效果，为宽噬噬菌体，不仅对中华鳖池塘分离的嗜水气单胞菌有很强的抑制效果，对对虾发病塘分离的副溶血弧菌也有较好的治疗效果。

综上，本次从中华鳖分离的噬菌体为肌尾噬菌体科宽噬噬菌体，对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌均有较好的抑制效果，且对中华鳖腐皮病有明显的治疗效果。本研究为噬菌体作为替代抗生素在中华鳖细菌病防控中的应用提供了一定的理论依据，后续将进一步开展规模化制备及生产评估试验等研究。

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