口服N-乙酰半胱氨酸对PM2.5染毒大鼠肺损伤的作用

空气中粒径在10 μm以下的颗粒物均可被吸入并沉积在呼吸系统中,其中粒径≤2.5μm的颗粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)富集多种重金属、有机污染物、酸性氧化物等,且是病原微生物的载体,吸入后可进入呼吸道深部,对人体的毒性和危害性更大[1-4]。近年来,我国大部分地区空气污染严重,呼吸道疾病的患病率呈逐年上升趋势,其中PM2.5被认为是重要的致病物质。研究表明:氧化应激损伤是PM2.5 损伤呼吸系统的重要机制之一[5],而N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)具有抗氧化应激作用,但对PM2.5所致肺损伤是否有效,及治疗剂量与效果是否具有量效关系尚不明确。为此,本课题制备PM2.5染毒SD大鼠肺损伤动物模型,并给予不同剂量NAC口服治疗,检测氧化应激、肺损伤程度及炎症反应等指标,探讨NAC对PM2.5染毒SD大鼠肺损伤的治疗作用,为NAC治疗PM2.5相关肺损伤提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 成年健康Sprague-Draw(SD)大鼠50只，均为雄性，体质量203～219 g，平均(211.8±7.8)g，购入后于室温22 ℃～28 ℃饲养，供标准口粮，自由饮食，饮用水为无菌饮用水，日照12 h/d，观察l周后实验。

1.2 PM2.5的采集及混悬液制备 应用崂应2030型中流量智能TSP采样器于2016年6月1日至10月30日在市中心采样,将颗粒物采集在直径9 cm的玻璃纤维滤膜上,采样结束后,将玻璃纤维滤膜剪碎放入50 ml超纯水中,超声震荡15 min洗脱,吸取洗脱液后再次加入50 ml超纯水继续超声震荡15 min,将两次洗脱液合并于锥形瓶中,经多层无菌纱布过滤后用低温离心机将洗脱液于4℃、10 000 r/min离心3次,每次20 min。弃上清液，将底层颗粒物进行真空冷冻干燥后合并颗粒物,将其低温冰箱保存。用生理盐水制备成浓度为40 mg/ml的颗粒物混悬液,超声振荡5 min使颗粒物混匀并灭菌。

1.3 实验方法 成年SD大鼠50只,采用随机数字表法分为5组,每组10只,采用气道滴入法制备动物模型。空白组经气道滴入生理盐水,对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组经气道滴入PM2.5灭菌悬液,均制作为PM2.5 染毒肺损伤动物模型。对照组不给予NAC干预治疗,治疗组分别给予口服低、中、高剂量NAC治疗。以上动物实验过程经动物伦理委员会评议同意实施。

1.3.1 PM2.5染毒肺损伤大鼠模型的制备:模型制备前大鼠自由进水,禁食12 h。称重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,将大鼠仰卧固定于操作台上,剪去颈毛消毒颈部皮肤,于颈部中线下段做1 cm切口,钝性分离皮下组织和肌肉,暴露气管,灌注针头于气管环状软骨间插入,按1 ml/kg剂量注入PM2.5混悬液,注射后将大鼠直立旋转数次,使PM2.5混悬液均匀分布于大鼠肺部,待大鼠呼吸节奏平稳后缝合切口。10只空白组按1 ml/kg剂量注射生理盐水,均给予16万U青霉素注射3 d预防感染。

1.3.2 PM2.5 染毒肺损伤大鼠NAC治疗方法:低剂量组给予NAC 300 mg/(kg·bw)口服,中剂量组给予NAC 600 mg/(kg·bw)口服,高剂量组给予NAC 1200 mg/(kg·bw)口服,连续治疗10 d。

1.4 检测方法 各组大鼠均于第10天时腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分离出气管,行气管插管并固定,收集股动脉血送检。开胸完整切除右肺制成肺病理标本。左肺用4℃无菌生理盐水经气管插管灌洗,回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)检测谷胱甘肽(glutathione,GSH)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。GSH采用GSH试剂盒检测(试剂盒为美国Cayman Chemical公司生产),LDH采用日立7170A全自动生化分析仪及专用试剂盒检测,将血浆和BALF样品所测得A值代入标准曲线,计算浓度。肺组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达采用免疫组化法,随机选取肺组织切片的5个视野,应用Meta Morph软件分析阳性细胞的光强度,光强度越高,则TNF-α蛋白表达越多。采用ELISA法检测肺组织匀浆中白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)和IL-18含量。IL-10、IL-18试剂盒均购自北京尚柏生物医学技术有限公司。

2 结果

2.1 口服不同剂量NAC对PM2.5染毒大鼠氧化应激及肺损伤治疗作用 对照组与各治疗组大鼠血浆和BALF中GSH水平均低于空白组,LDH水平高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组大鼠GSH水平均高于对照组,LDH水平低于对照组(P<0.05)。低、中、高3个治疗组大鼠血浆和BALF中GSH和LDH水平差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血浆和BALF中LDH、GSH水平比较

注：与空白组比较,*P<0.05;与对照组比较,△P<0.05;与低剂量组比较,▲P<0.05;与中剂量组比较,#P<0.05

2.2 不同剂量NAC口服对PM2.5染毒大鼠炎症反应的影响 对照组与各治疗组大鼠肺组织中TNF-α、IL-10、IL-18含量均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。各治疗组大鼠肺组织中TNF-α、IL-10、IL-18含量均低于对照组(P<0.05)。高剂量组大鼠肺组织中TNF-α、IL-10、IL-18含量低于低剂量组(P<0.05)。低剂量组与中剂量组、高剂量组与中剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-10、IL-18含量比较

注：与空白组比较,*P<0.05；与对照组比较,△P<0.05；与低剂量组比较,▲P<0.05

3 讨论

3.1 NAC对炎症反应的作用 TNF-α是重要的前炎性细胞因子,异常升高的TNF-α可通过以下途径或机制引起肺损伤。(1)与肺组织TNF-α受体结合,使溶酶体受损外泄，直接损伤肺组织及毛细血管等;(2)刺激血管内皮细胞,上调肺血管内皮细胞间黏附分子-1表达,增加毛细血管通透性,致白细胞等向炎症部位迁移,引起肺损伤[6-7];(3)TNF-α可诱导巨噬细胞和内皮细胞合成、释放IL-18等前炎性细胞因子,促进炎症反应,并进一步放大炎症信号,产生级联放大作用,加重肺损伤[8]。IL-18也是一种强烈的细胞免疫刺激因子,炎症反应时IL-18可造成组织损伤。IL-10是由单核巨噬细胞产生的一种抗炎性细胞因子,相关研究发现,机体在急性炎症反应出现时,多种细胞炎症因子,包括TNF-α、IL-18、IL-10等表达升高,可在24～72 h达峰值。本研究结果显示,对照组肺组织TNF-α、IL-10、IL-18含量高于空白组,差异有统计学意义。说明PM2.5可导致肺部炎症,刺激免疫系统产生大量的促炎因子和抗炎因子。 NAC治疗后,肺组织TNF-α、IL-10、IL-18含量均较对照组明显降低,可能是NAC治疗后炎症反应减轻,其诱导的淋巴细胞、单核巨噬细胞分泌的IL-10减少。

3.3 NAC对肺损伤的作用 LDH是一种糖酵解酶,由2种亚基M和H组成,分布于所有组织器官中,而且其分布组织特异性明显,是临床诊断组织器官损伤的特异性指标之一。正常生理状态新陈代谢下,血浆中LDH含量处于正常值范围,在肝脏和肌肉组织中以LDH5为主,在心脏组织中以LDH1为主,在肺组织中以LDH3为主。一旦组织细胞非正常大量损伤时,会有大量LDH分子漏出[11],导致血浆LDH水平升高。PM2.5染毒大鼠发生肺损伤时,肺间质和实质细胞产生大量LDH3,并释放至血中,导致血浆和BALF中LDH水平升高。检测血浆和BALF中LDH活性可判断肺组织损伤程度。本研究结果显示,对照组LDH活性明显高于空白组,差异有统计学意义,提示PM2.5可致大鼠肺损伤。NAC治疗后LDH活性均低于对照组,且高剂量、中剂量、低剂量治疗组间GSH水平从低到高排列,差异有统计学意义,提示NAC治疗可减轻肺损伤。

综上所述,PM2.5对呼吸系统有多种损伤作用,氧化应激损伤是重要机制之一。本研究结果初步证实了口服NAC对PM2.5所致的肺损伤具有治疗作用,作用机制可能在于减轻氧化应激、控制炎症反应而实现,且治疗剂量与效果存在一定的量效关系。相关的研究结果有待于更大样本实验加以验证,其所涉及的信号通路值得进一步探讨。

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