骨碎补总黄酮基于Notch信号通路改善骨质疏松的作用及机制研究

韩亚力 罗 奕 曾佳学

(六盘水市人民医院骨科，六盘水 553000)

骨质疏松症是临床上较为常见的疾病之一，主要是以骨组织微结构退化、以骨量减少为主要特征[1]。中药骨碎补具有维持骨微结构的完整程度和提高骨密度等作用[2]。骨碎补总黄酮(Davallia mariesil flavones,DMF)为骨碎补中的主要成分，但关于骨碎补总黄酮改善骨质疏松的机制尚未可知。Notch信号通路中的多个信号分子参与多种疾病的发生和发展过程已被证实[3-5]，但是关于Notch信号通路中各个信号分子，包括受体Notch 1、Notch 3及下游靶基因Hes-1家族在骨质疏松患者组织中的表达研究很少。本研究将探讨DMF通过抑制Notch信号通路中Notch 1及下游靶基因Hes-1，缓解骨质疏松症状的分子机制，期望为骨质疏松治疗探索新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料 选取2016年1月～2017年1月间我院收治的120例骨质疏松患者作为研究对象。纳入标准：①根据WHO推荐诊断标准确诊为骨质疏松；②体力状况(Performance status，PS)评分0～2分，预计生存期>3个月。排除标准：①合并慢性感染性疾病、心肺功能障碍、恶性肿瘤者或其他重大疾病患者；②合并心理疾病、精神疾病患者。本研究采用回顾性分析的方法，把入选病例随机分为试验组和对照组，每组60例，试验组60例，男29例，女31例，年龄40～86岁，平均(58.3±2.9)岁，体力状况评分：0～1分40例，2分20例。对照组60例，男30例，女30例，年龄41～84岁，平均(56.9±3.1)岁，体力状况评分：0～1分43例，2分17例。两组患者的一般资料性别、年龄、体力状况比较无明显差异(P>0.05)，资料具有可比性。本研究通过我院伦理委员会审核，所有患者在治疗前均知情同意。

1.1.2实验动物 出生24 h的新生SD大鼠，1月龄SD大鼠，6月龄SD雌性大鼠(由中国科学院上海实验动物中心提供)。

1.1.3实验药物 强骨胶囊(成分为骨碎补总黄酮，davallia mariesil flavones，DMF)：国药准字Z20030007，北京岐黄制药有限公司生产，规格：DMF 180 mg/粒。

1.1.4主要试剂和仪器 二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司；Notch-1、Hes-1及GAPDH一抗均购自Cell Signaling Technology公司；二抗购自碧云天公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自TaKaRa Bio公司；TNF-α、MCP-1、IL-6试剂盒均购自南京生物建成研究所。TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；7300型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；基础电泳仪(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(Thermo公司)；EL204-电子天平(上海特勒-托多利多仪器有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2方法

1.2.1治疗方法 试验组用强骨胶囊(国药准字Z20030007，北京岐黄制药有限公司生产，规格：DMF 180 mg/粒)联合治疗钙尔奇D(惠氏一百宫制药有限公司，维生素D 125 U/片，钙600 mg/片)治疗[6]。2粒/次，3次/日。对照组单纯用钙尔奇D(惠氏一百宫制药有限公司，维生素D 125 U/片，钙600 mg/片)治疗。1片/次，1次/日。3个月为一个疗程，使用2个疗程。

1.2.2检测指标 (1)临床疗效：骨质疏松症患者疗效评价标准：无效：疼痛感无减轻，骨密度无改变；有效：腰背部存在轻度疼痛，骨密度提高；显效：骨质疏松症状消失，骨密度显著提高。临床总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。(2)血钙和血磷测定 采血，3 000 r/min离心5 min，分离上层血清，采用全自动生化仪检测血钙、血磷。(3)炎症因子指标的测定：分别在用药前后取患者血液于3 000 r/min离心10 min，分离血清，按各试剂盒说明书的要求测定炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量。试剂盒均购自南京生物建成研究所。

1.2.3含药血清的制备 将6月龄的SD大鼠，随机分成2组：蒸馏水组和DMF组，每组12只。DMF组：按1 800 mg/kg体重进行灌胃强骨胶囊悬液；蒸馏水组：按17.5 ml/kg体重进行灌胃蒸馏水；2次/d，连续灌胃3 d。接着含药血清制备方法参考文献[7]。

1.2.4骨髓基质细胞的分离与鉴定 取1月龄SD大鼠的股骨和胫骨，分离骨髓基质细胞，分离和鉴定方法参考文献[8]。

1.2.5RT-PCR检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1 mRNA表达水平 采用Notch激活剂Jaggedl蛋白(1 000 μg/L)和抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT，16 μmol/L)，利用维甲酸(Retinoic acid，RA)建立骨质疏松模型，探讨DMF改善骨质疏松的作用是否与Notch信号通路有关。取对数生长期的大鼠骨髓基质细胞，以5×103ml-1浓度接种于6孔板，每组设置3个复孔。用含10%胎牛血清的〗DMEM培养基培养在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h至贴壁，实验分组与给药：①NC组：DMEM高糖完全培养液(含10% FBS)；②RA组：RA(0.4 mmol/L)；③DMF+RA组：DMEM高糖完全培养液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)；④Jaggedl+RA组：Jaggedl[1 000 μg/L+RA(0.4 mmol/L)]；⑤Jaggedl+DMF+RA组：Jaggedl(1 000 μg/L)+DMEM高糖完全培养液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)；⑥DAPT+RA组：DAPT(16 μmol/L)+RA(0.4 mmol/L)；⑦DAPT+DMF+RA组：DAPT(16 μmol/L)+DMEM高糖完全培养液(含DMF的血清)+RA(0.4 mmol/L)。根据Trizol试剂盒提取组织总RNA，采用核酸测定仪测定RNA纯度和浓度，取1 μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行定量检测，Notch-1、Hes-1及GAPDH(内参)扩增引物序列如表1，扩增条件及计算方法参考文献[9]。

1.2.6Western blot检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1蛋白的表达水平 细胞培养与给药方法同1.2.3项下，常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，每孔上样20 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脱脂奶封闭2 h，分别孵育Notch-1、Hes-1(目的蛋白)和GAPDH(内参蛋白)一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜，孵育二抗后显影。采用Quantityone软件对条带亮度进行分析。

1.2.7免疫组化检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1蛋白的表达水平 采用常规方法制备5 μm厚的石蜡切片，进行免疫组化染色，在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的热激30 min介导抗原复性，采用抗Notch-1、Hes-1单克隆抗体孵育，4℃过夜。洗涤后孵育二抗，加显色液后进行曝光。根据染色强度(0～3分，0分为无染色，1分为弱染色，2分为中度染色，3分为强染色)进行判分。

2 结果

2.1临床疗效 试验组总有效率高于对照组总有效率(91.67%>76.67%)，P<0.05，具体见表2。

2.2两组患者血钙和血磷水平比较 两组患者治疗前血钙和血磷水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组患者血钙和血磷水平较治疗前均升高(P<0.05)；治疗后，试验组血钙和血磷水平高于对照组(P<0.05)，具体见表3。

2.3炎症因子水平比较 两组患者治疗前TNF-α、MCP-1、IL-6水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后两组患者TNF-α、MCP-1、IL-6水平较治疗前均降低(P<0.05)；治疗后，试验组TNF-α、MCP-1、IL-6水平低于对照组(P<0.05)，具体见表4。

2.4RT-PCR检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1 mRNA表达水平 与RA组相比，Jaggedl+RA组中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均上调，DMF+RA组、DAPT+RA组中Notch-1、Hes-1 mRNA均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与Jaggedl+RA组相比，Jaggedl+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与DAPT+RA组相比，DAPT+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 mRNA水平均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。具体见表5。

2.5Western blot检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1蛋白的表达水平 与RA组相比，Jaggedl+RA组中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均上调，DMF+RA组、DAPT+RA组中Notch-1、Hes-1 蛋白均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与Jaggedl+RA组相比，Jaggedl+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与DAPT+RA组相比，DAPT+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 蛋白水平均下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。具体结果表6、图1。

表1RT-PCR引物设计

Tab.1RT-PCRprimerdesign

GeneForwardprimerReverseprimerNotch⁃15′⁃CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC⁃3′5′⁃CAGCCACTCGCATTGACCAT⁃3′Hes⁃15′⁃AGGCGGCTAAGGTGTTTGGAGG⁃3′5′⁃GGCCGCTGGAAGGTGACACTG⁃3′GAPDH5′⁃ACCCATCACCATCTTCCAGGAG⁃3′5′⁃GAAGGGGCGGAGATGATGAC⁃3′

2.6免疫组化检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1蛋白的表达水平 与RA组相比，Jaggedl+RA组中Notch-1、Hes-1 免疫组化评分均升高，DMF+RA组、DAPT+RA组中Notch-1、Hes-1免疫组化评分均下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与Jaggedl+RA组相比，Jaggedl+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 免疫组化评分均下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与DAPT+RA组相比，DAPT+DMF+RA组中Notch-1、Hes-1 免疫组化评分均下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)。具体结果图2、3,表7。

表2两组患者临床疗效比较

Tab.2Comparisonclinicalefficacyoftwogroups

GroupsnExcellent[n(%)]Effective[n(%)]Invalid[n(%)]Totaleffectiverate(%)Experimentgroup6020(33 33)35(58 33)5(8 33)91 671)Controlgroup6016(26 67)30(50 00)14(23 33)76 67

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

GroupsTimeBloodcalcium(mg/L)Bloodphosphorus(mg/L)ExperimentgroupBeforetreatment82 82±1 3131 82±0 83Aftertreatment118 22±1 551)2)67 98±0 351)2)ControlgroupBeforetreatment80 92±1 3331 78±0 93Aftertreatment100 81±1 561)51 38±0 131)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.05;compared with control group,2)P<0.05.

GroupsTimeTNF⁃α(pg/ml)MCP⁃1(pg/ml)IL⁃6(pg/ml)ExprerimentgroupBeforetreatment182 82±1 31131 82±0 83141 82±0 83Aftertreatment108 22±1 551)2)57 98±0 351)2)67 98±0 351)2)ControlgroupBeforetreatment180 92±1 33131 78±0 93141 78±0 93Aftertreatment140 81±1 561)71 38±0 131)81 38±0 131)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.05;compared with control group,2)P<0.05.

GroupsRelativemRNAlevelsNotch⁃1Hes⁃1NC0 99±0 040 99±0 02RA1 79±0 071)1 85±0 051)DMF+RA1 41±0 053)1 50±0 103)Jaggedl+RA1 97±0 032)1 98±0 062)DAPT+RA1 27±0 053)1 37±0 043)Jaggedl+DMF+RA1 61±0 054)1 78±0 034)DAPT+DMF+RA1 11±0 055)1 21±0 055)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

GroupsRelativeproteinlevelNotch⁃1Hes⁃1NC0 23±0 040 26±0 04RA0 67±0 111)0 70±0 061)DMF+RA0 45±0 083)0 48±0 033)Jaggedl+RA0 83±0 032)0 88±0 042)DAPT+RA0 35±0 043)0 40±0 053)Jaggedl+DMF+RA0 53±0 044)0 58±0 054)DAPT+DMF+RA0 28±0 045)0 31±0 045)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

图1 Western blot检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1蛋白的表达水平Fig.1 Western blot were performed to assess protein levels of Notch-1,Hes-1 in mice bone marrow stromal cells

图2 免疫组化检测大鼠骨髓基质细胞Notch-1蛋白的表达水平Fig.2 Immunohistochemistry were performed to assess protein levels of Notch-1 in mice bone marrow stromal cells

3 讨论

骨质疏松症是临床上较为常见的疾病之一，其具有较高的发病率，主要是以骨组织微结构退化、以骨量减少为主要特征。Notch信号通路参与多种疾病的发生和发展，其调控细胞多种进程[10-12]。Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4是Notch受体，当Notch配体与Notch受体特异性结合后，Notch信号通路随后被激活，进而激活下游靶基因Hes家族的转录[13]。Hes-1作为Notch信号通路下游靶基因Hes-1家族的主要成员，也随之被激活[14-16]。目前，关于Notch信号通路中各个信号分子，包括受体Notch-1、Notch-3等及下游靶基因Hes-1家族在骨质疏松组织中的表达研究较少，对此本文将进一步探讨。

图3 免疫组化检测大鼠骨髓基质细胞Hes-1蛋白的表达水平Fig.3 Immunohistochemistry were performed to assess protein levels of Hes-1 in mice bone marrow stromal cells

GroupsScoreresultNotch⁃1Hes⁃1NC0 13±0 040 16±0 04RA2 67±0 111)2 70±0 061)DMF+RA1 95±0 083)1 98±0 033)Jaggedl+RA2 83±0 032)2 88±0 042)DAPT+RA1 35±0 043)1 40±0 053)Jaggedl+DMF+RA2 33±0 044)2 38±0 054)DAPT+DMF+RA0 48±0 045)0 51±0 045)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with RA group,2)P<0.05,3)P<0.01;compared with Jaggedl+RA group,4)P<0.05;compared with DAPT+RA group,5)P<0.05.

临床研究结果发现，DMF试验组总有效率高于对照组总有效率；治疗后试验组血钙和血磷水平高于对照组，而TNF-α、MCP-1和IL-6水平低于对照组。试验组Notch-1、Hes-1蛋白表达量低于对照组Notch-1、Hes-1蛋白表达量，结果提示骨碎补总黄酮可改善骨质疏松症，且其机制可能与Notch信号通路相关。接着在分离培养大鼠骨髓基质细胞进行体外实验研究，采用Notch激活剂Jaggedl和抑制剂DAPT，利用RA建立骨质疏松模型，探讨DMF改善骨质疏松的作用是否与Notch信号通路有关。研究发现DMF同DAPT(Notch阻断剂)一样，可以下调RA所致的大鼠骨髓基质细胞Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平升高。Jaggedl作为Notch激动剂，可部分逆转DMF对大鼠骨髓基质细胞上述基因和蛋白的调控作用。

综上所述，骨碎补总黄酮可改善骨质疏松症，且其机制可能与抑制Notch信号通路相关。

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