沉默转导重排基因对抑制乳腺癌细胞增殖和迁移的影响*

崔军威，杨 满，郝 璐，程 苒，于志强，韦 伟

北京大学深圳医院(深圳 518036)

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性身心健康，其发病率是我国女性恶性肿瘤的首位，且还在以每年2%的速度递增[1]。随着对乳腺癌分子病理机制和生物学特性研究的深入，对于乳腺癌的治疗已从传统的手术、化疗、放疗等方式深入到分子靶向治疗。许多原癌基因突变与疾病发生、发展的密切相关。近年来，Boulay等[2]发现转导重排基因(rearranged during transfection，RET)蛋白在ER阳性的乳腺癌中过表达，并对乳腺癌的发生、发展起到重要作用。RET蛋白在乳腺癌细胞中有重要功能：雌激素导致RET蛋白的过表达，RET蛋白增强雌激素驱动的生长作用，此外，RET能够增强RET通路-雌激素受体通路之间的相互作用。磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中，PI3K/AKT/mTOR上游成员，如雌激素受体ERα等，在乳腺瘤生成中起重要作用，PI3K/AKT/mTOR信号转导通路与乳腺癌发生密切相关，使之成为乳腺癌新的治疗靶点和研究热点。本课题采用荧光定量方法，检测60例乳腺癌组织及癌旁组织中RET蛋白的表达，探讨其与乳腺癌关系。采用RET siRNA分别转染乳腺癌细胞MCF-7及内分泌耐药株MCF-7/Aro，检测沉默RET对细胞增殖、侵袭的影响，同时检测RET基因及PI3K/AKT/mTOR 通路等表达情况，以探讨RET基因在乳腺癌细胞中的作用机制，阐明RET在乳腺癌发生、发展中的作用，以及对 PI3K/AKT/mTOR等信号途径的作用，为研究乳腺癌治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 胎牛血清、1640培养基(美国Gibco公司)；Lipofectamine 2000、Trizol(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(日本TAKARA公司)；RET-siRNA-BC(正义链:5'-ACGUUGAUGCCACUGAAUGCC-3'；反义链:5'-CAUUCAGUGGCAUCAACGUCC-3')、RET-siRNA- NC(正义链5'-ACCCGAUACUAAUGGGGU UCC-3'；反义链5'-GGAACCCCATTAGTAT CGGGT-3')由广州锐博合成；Annexinv-FITC/PI凋亡试剂盒和周期检测试剂盒(南京凯基)；总蛋白提取试剂盒(碧云天)；一抗PI3K、 AKT1、mTOR(美国Abcam公司)；一抗RAS、重组人丝裂原活化激酶(MEK)1、MEK2和RET(美国SantaCruz公司)；羊抗兔IgG抗体(武汉博士德)。

1.1.2 实验细胞与组织来源 乳腺癌细胞MCF-7及内分泌耐药细胞株MCF-7/Aro由广州优迪生物科技股份有限公司提供。60例乳腺癌组织及20例癌旁组织来源于2015年6月至2016年6月在北京大学深圳医院确诊的乳腺癌女性患者，患者均为接受以手术为主的综合治疗，有完整的临床及病理资料。本研究通过本医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.1.3 主要仪器设备 实时荧光定量PCR仪、酶标仪、电泳仪、转膜仪均购自美国Bio-Rad公司，倒置荧光显微镜购自明美光电技术公司，流式细胞仪guava easycyte购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测组织中RET相对表达量 60例乳腺癌组织及20例癌旁组织经研磨后，Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录为cDNA，按照试剂盒SYBR Green法步骤进行扩增，RET引物序列：上游：5'-TGTCCCCTCTG CACTATCCTT-3'，下游：5'-GGTTCAGAGCAGACTTTGGTT-3'。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s， 60 ℃ 30 s，共扩增40个循环，每个样本设3个复孔。

1.2.2 细胞培养及转染 乳腺癌细胞MCF-7及内分泌耐药细胞株MCF-7/Aro，1640培养基常规传代培养。于转染前1 d，分别接种于6孔板中，细胞密度为3×105个/孔，转染前汇合成单层细胞，密度大约在80%。实验分为3组，阴性对照组(NC)、空白组(BC)和RET干扰片段转染组(RET-siRNA)，在Lipofectamine 2000介导下分别转染，转染48 h后，荧光显微镜拍照检测转染效率，并用Western-blot和RT-PCR鉴定转染效果。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取已稳定转染的MCF-7和MCF-7/Aro细胞，调整细胞密度为3×105个/mL，接种于96孔板中，100 μL/孔，分别培养0、24、48、72 h。每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h后，弃孔内培养液；每孔加入150 μL DMSO，震荡使结晶物充分溶解。在酶标仪测量各孔在490 nm处的吸光度OD值，每个样本重复3次。

1.2.4 Transwell 取已稳定转染的MCF-7和MCF-7/Aro细胞，接种于 Transwell 小室上室，密度为1×105个/孔，上室加入1 mL无血清1640培养基，下室加入1 mL含10%胎牛血清的1640培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。吸掉培养基，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，0.5%结晶紫染色10 min，轻轻刮掉上室内细胞，用PBS洗2次。显微镜下随机选取10个视野，观察并计数细胞个数。

1.2.5 PI3K/AKT/mTOR通路相关基因相对表达量检测 收集各组细胞，按照试剂盒说明书操作进行RNA提取和逆转录。以GADPH作为内对照，荧光定量PCR检测各组细胞mRNA水平。引物序列如下所示(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.6 Western-blot检测PI3K/AKT/mTOR等相关通路蛋白的表达 配置12% SDS-PAGE 分离胶，5%浓缩胶。样品1∶1与5×上样缓冲液混匀，95 ℃变性8 min上样。75 V浓缩胶，120 V分离胶，电泳2～3 h。恒流200 mA，转膜30 min。将膜置于预先配好的封闭液(5%脱脂奶粉)中，37 ℃摇床温育1 h。一抗稀释液将抗体稀释至工作浓度，37 ℃摇床温育1 h。Blot清洗液清洗3次后，稀释HRP标记的二抗至工作浓度，37 ℃摇床温育1 h。Blot清洗液清洗3次后，ECL 发光液A液和B液等体积混合后与膜上蛋白充分接触5 min后，弃残液。将膜转入暗匣中，进暗室曝光显影。用全自动凝胶成像系统进行灰度扫描并计算各组相对灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中RET表达情况

RT-PCR结果显示，乳腺癌组织中RET mRNA的相对表达量高于癌旁组织(2.70±1.37 vs. 1.29±0.51)，差异有统计学意义(t=4.5431，P<0.05)(图1)。

图1 乳腺癌组织及癌旁组织中RET mRNA表达情况

注：与癌旁组织比较，**P<0.05

2.2 RET表达量鉴定

RET-siRNA转染MCF-7和MCF-7/Aro细胞48 h和72 h后，分别进行RT-PCR和Western-blot检测RET表达情况，同时镜下观察转染效率。MCF-7转染效率为62%，MCF-7/Aro转染效率为65%，与BC组和NC组比较，转染RET-siRNA可明显降低RET的表达(F=13.59，P=0.003)，表明RET-siRNA干扰效率高，可用于后续实验(图2)。

图2 RET-siRNA转染效率鉴定

注：A:转染后48 h，MCF-7及MCF-7/Aro 中RET mRNA相对表达量；B: 转染后72 h，MCF-7及MCF-7/Aro 中RET 蛋白相对表达量(Western-blot)；C:转染后72 h，MCF-7及MCF-7/Aro中RET蛋白相对表达量(相关灰度值分析);与NC组和BC组比较，*P<0.05

2.3 沉默RET对MCF-7和MCF-7/Aro细胞迁移能力的抑制作用

Transwell检测沉默RET对乳腺癌细胞迁移的抑制作用结果表明，MCF-7和MCF-7/Aro细胞株经RET-siRNA作用24 h后，RET-siRNA组穿膜细胞数较BC组和NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示沉默RET可明显抑制MCF-7和MCF-7/Aro细胞的迁移能力(图3)

图3 Transwell检测RET-siRNA对MCF-7和MCF-7/Aro细胞迁移作用

注：A: MCF-7和MCF-7/Aro细胞株转染24 h后细胞迁移情况；B: MCF-7和MCF-7/Aro细胞株转染24 h后细胞迁移数量；与NC组和BC组比较，*P<0.05

2.4 RET-siRNA抑制乳腺癌细胞株的增殖

MTT法检测沉默RET对乳腺癌细胞增殖的抑制作用结果表明，MCF-7和MCF-7/Aro细胞株经RET-siRNA作用0、24、48、72 h后，细胞增殖均被抑制，并且随着作用时间的增加，抑制增殖作用逐渐增强(图4)。

2.5 沉默RET对MCF-7和MCF-7/Aro细胞PI3K/AKT/mTOR通路抑制作用

RT-PCR和Western-blot检测沉默RET对PI3K/AKT/mTOR通路结果表明，MCF-7和MCF-7/Aro细胞株经RET-siRNA作用48 h和72 h后，RET-siRNA组P-mTOR、MEK1、MEK2、P-AKT、PI3K在基因和蛋白水平上表达较BC组和NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示沉默RET可明显抑制MCF-7和MCF-7/Aro细胞PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达(图5～6)。

注：A： MCF-7细胞株PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达情况；B: MCF-7/Aro细胞株PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达情况；与NC组和BC组比较，*P<0.05

图6 Western-blot检测RET-siRNA对PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白影响

注：A: MCF-7、 MCF-7/Aro细胞株PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达情况；B: 图A中MCF-7 PI3K/AKT/mTOR通路蛋白相关灰度值计算；C:图A中MCF-7/Aro PI3K/AKT/mTOR通路蛋白相关灰度值计算；与NC组和BC组比较，*P<0.05

3 讨论

RET原癌基因是定位于10q11.2，编码一种跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体，它调节细胞的正常生理功能[3]，对神经内分泌系统、肾发育和调节神经细胞的增殖、分化、迁移及胃肠神经系统的发育都起着重要作用[4]。RET蛋白是一种蛋白聚合体，是细胞生长、分化及相关信号转导的细胞表面分子[5-6]，其突变与多种疾病的发生密切相关，如甲状腺癌、先天性巨结肠癌等[7-8]。RET基因特异位点的点突变可以增强RET蛋白的转化能力，激发酪氨酸激酶自动磷酸化，诱导细胞增生过度以至癌变[9]。研究[10]发现，正常甲状腺细胞外源性表达RET原癌基因是诱导表达炎症基因和肿瘤基因，引发一系列炎症反应和肿瘤侵袭。研究[11]发现，ER阳性的乳腺癌患者中存在着RET高表达，RET蛋白能增强RET通路-雌激素受体通路之间的相互作用，导致乳腺癌的发生、发展。本研究结果发现，60例乳腺癌患者中存在着RET过表达，沉默RET后，MCF-7和MCF-7/Aro细胞中RET表达下降，细胞增殖和迁移能力受抑制，提示RET-siRNA能有效抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭。

Boulay[12]等人通过MCF-7/Aro以及T47D/Aro乳腺癌细胞系为研究对象，证明PI3K/AKT/mTOR通路参与雌激素乳腺肿瘤细胞生长增殖过程。Plaza等[13]研究发现，RET通过激活其配体GDNF导致Ser118和Ser167上的ERα磷酸化，增加ERα转录活性的雌激素非依赖性激活，并且ERα阳性乳腺癌细胞系可导致ERK1/2和AKT通路的激活，沉默GDND可抑制RET下游信号通路PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达，减轻芳香酶抑制剂耐受性。

PI3K/AKT/mTOR信号转导通路作为细胞内信号传导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用。RET基因突变可导致PI3K/AKT等下游信号激活，信号转导活性增强，细胞过度增殖，形成肿瘤。本研究采用siRNA沉默RET，PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白在基因和蛋白水平均表现明显下调，表明RET沉默后抑制PI3K/AKT等下游信号激活。

综上所述，RET-siRNA能有效抑制RET基因的表达，抑制乳腺癌细胞增殖侵袭，其作用机制可能是通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白，进而抑制乳腺癌细胞增殖。乳腺癌与RET酪氨酸蛋白激酶受体的密切生物学关系，使RET基因成为一种新型的潜在的人类乳腺癌治疗靶标。

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