FGF19调控肿瘤细胞增殖和自噬的生物学功能研究*

邓晓微，杨 婵，王嘉宝，尹小菲，李静怡

成都医学院 生物医学系(成都 610500)

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是一类具有多种功能的多肽细胞因子大家族，FGFs由垂体和下丘脑分泌，由大约200个氨基酸组成，家族成员间有一定的氨基酸同源性，核心区域约由120个氨基酸组成，具有高度同源性[1]。根据序列同源性及系统发生和结构分析，哺乳动物FGF家族分为5个旁分泌/自分泌作用亚家族和1个内分泌作用亚家族。FGFs参与组织内环境稳定、再生和代谢，是正常细胞生长、分化和增殖的关键信号分子[2-3]。迄今，共有23种FGF(FGF1～23)配体，其能够与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合。目前仅发现4种人类FGFR：FGFR1至FGFR4。近期，还发现了FGFR5，但尚不清楚该受体的功能[4]。

自噬是一种被高度调控的细胞压力应答过程[5]。研究[6]表明，自噬在肿瘤发生发展过程中扮演着重要作用。一方面，在肿瘤中通常可以检测到自噬相关基因的缺失和突变，表明自噬有抑制肿瘤的作用[7-8]。另一方面，肿瘤细胞可以通过自噬途径降解脂滴和线粒体等方式回收营养物质，减少能量消耗，有利于肿瘤细胞存活[9]。

诸多研究[10]表明，FGFs过表达与恶性肿瘤的发生相关，如胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等。FGF19属于FGF家族中的一员，属于内分泌作用亚家族，调节组织修复后期阶段的代谢，和其同源基因FGF15一同调节肝脏中的胆汁酸代谢，与FGFR4特异性结合后才能发挥其生物学效应[11]。目前，研究[12]发现，FGF19在诸如食管鳞癌、结肠癌和乳腺癌等实体瘤中高表达，与肿瘤发生密切相关，但FGF19对肿瘤细胞自噬的调节鲜见报道。本研究拟以肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MKN45为模型，探讨FGF19在调控肿瘤细胞增殖和自噬中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 实验材料 人肝癌细胞HepG2由成都医学院张涛副教授惠赠，胃癌细胞MKN45来源于中科院上海细胞库。

1.1.2 药物与试剂 DMEM/HIGH GLUCOSE(美国HyClone)，RPMI-1640(美国HyClone)，PageRuler Prestained Protein Ladder (美国Thermo)，FGF19重组蛋白(上海信裕生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(上海贝博生物)，pAb anti-LC3B(日本MBL)，SQSTMI Rabbit PolyAb (美国Proteintech)，羊抗兔(LC3)/羊抗鼠(β-actin)二抗，FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，伊曲康唑(萨恩化学技术上海有限公司)。

1.1.3 主要仪器 电热恒温水浴锅(上海跃进S.HH.W21-600-II)，离心机(美国Thermo)，电子天平(JY5002，上海)，超净工作台(日本Airtech)，液氮罐(成都金凤液氮罐)，制冰机(意大利Castel MAC)，恒温摇床(江苏QILINBETER)，pH计(phs-320，成都试剂方舟科技有限公司)，漩涡震荡仪(北京HYQ-2121A)，凝胶成像系统(上海Bio-Rad)，灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，荧光倒置相差显微镜(日本Olympus)，纯水仪(成都SARTORIUS)，干燥箱(上海齐欣科学仪器厂)，-20 ℃冰箱(荣事达BCD-265)、-80 ℃冰箱(美菱BCD-238)，程序降温盒(美国Nalgene)，蛋白质印迹装置(上海Bio-Rad)，冷冻离心机(美国Thermo)，CO2恒温培养箱(美国Thermo)，酶联免疫检测仪(上海Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞增殖情况的测定 1)光镜下观察增殖 取对数生长期细胞，加入六孔板中(6×105/孔 、2 mL/孔)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞贴壁后，在六孔板中分别加入2 mL新鲜培养基(对照组)及不同浓度FGF19重组蛋白，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。光学显微镜下观察并拍照。2)CCK-8检测细胞增殖 取对数生长期的细胞加入96孔板中(2×103/孔、200 μL/孔)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸出96孔板中的培养基，分别加入200 μL新鲜培养基及不同浓度FGF19重组蛋白工作液，置于恒温培养箱中培养24 h， 然后按照CCK-8试剂盒说明书检测细胞增殖情况。

1.2.2 免疫印迹 取对数生长期细胞，加入六孔板中(6×105/孔、2 mL/孔)，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。待细胞贴壁后，在六孔板中分别加入2 mL新鲜培养基(对照组)及不同浓度FGF19重组蛋白。置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h后收集细胞。用Ripa裂解液裂解细胞，提取蛋白。用12%的SDS-PAGE对蛋白(40 μg)进行电泳及转膜，将转好的PVDF膜用2%的脱脂奶粉封闭37 ℃，1 h，然后一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗3次，每次10 min。二抗37 ℃孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min。按照显影液：TBST=1∶3比例稀释，曝光机上曝光成像。

1.2.3 免疫荧光 1)FGF19重组蛋白处理细胞：取对数生长期细胞，加入已铺好爬片的24孔板中(1×104/孔、1 mL/孔)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞贴壁，按照不同条件处理细胞后，将24孔板置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。2)免疫荧光：取出24孔板，使用PBS溶液进行洗涤，然后每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗涤2次，每次1 min。2%Triton X-100处理15 min。PBS洗涤2次，每次1 min。5%脱脂奶粉封闭30 min。使用PBS洗涤2次，每次1 min。PBS稀释LC3一抗，比例为1∶200，一抗4 ℃过夜。使用PBS洗涤3次，每次10 min。PBS按照1∶100比例稀释FITC标记山羊抗兔IgG二抗，置于37 ℃孵育1 h，从二抗开始全程避光操作。使用PBS洗涤2次，每次10 min。在载玻片上滴加少量甘油，将爬片取出附于其上，使用荧光显微镜进行拍照并观察荧光斑点的数量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 加药后细胞生长情况

加入不同浓度FGF19重组蛋白处理24 h后，HepG2细胞生长情况与对照组HepG2细胞生长情况比较，差异有统计学意义。在10×放大倍数的显微镜下观察：加入FGF19重组蛋白浓度为50 ng/mL的HepG2细胞生长与对照组比较，差异无统计学意义；加入浓度为100 ng/mL的FGF19重组蛋白培养24 h后，相较于对照组，HepG2细胞数量明显增加。在20×放大倍数的显微镜下亦能得到相同的结论。当FGF19重组蛋白浓度为50 ng/mL、培养24 h对HepG2细胞未有较明显的促进或抑制作用； 当FGF19重组蛋白浓度为100 ng/mL、培养24 h时对HepG2细胞有明显促进增殖的作用(图1)。在胃癌细胞MKN45中，结果表明，FGF19处理能促进其增殖。但胃癌细胞MKN45对FGF19的敏感度与HepG2细胞比较稍有差异，结果显示：就MKN45细胞而言，25 ng/mL和50 ng/mL FGF19重组蛋白处理能够促进MKN45细胞增殖，而加入100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理48 h后相对于对照组并没有明显的变化(图2)。

图1 不同浓度FGF19重组蛋白处理24 h后HepG2细胞的生长情况注：A:放大倍数为10×的光学显微镜下的观察结果；B:放大倍数为20×的光学显微镜下的观察结果

图2 不同浓度FGF19重组蛋白处理48 h后MKN45细胞的生长情况注：A:放大倍数为10×的光学显微镜下的观察结果；B:放大倍数为20×的光学显微镜下的观察结果

2.2 CCK-8检测细胞增殖情况

由于CCK-8试剂的特性，当96孔板内活细胞数目愈多，加入CCK-8后的培养基颜色就越深， 450 nm处OD值越大。可以认为，在相同培养条件及相同时间下，OD值越大，细胞生长速率越快。将所测OD值进行数据分析：当使用浓度为50 ng/mL和100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h时OD值明显增大，但加入浓度为200 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h时，与对照组比较，差异无统计学意义。其中，使用浓度为100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h的细胞与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。将测得的MKN45细胞数据进行分析：当使用浓度为25 ng/mL和50 ng/mL的FGF19重组蛋白处理MKN45细胞48 h时OD值明显增大，但加入浓度为100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理48 h时与对照组比较，差异无统计学意义。其中，使用浓度为25 ng/mL的FGF19重组蛋白处理48 h的细胞与对照组比较，差异有统计学意义(图4)。CCK8结果显示，FGF19能够促进肿瘤细胞增殖。

注：*P<0.05，**P<0.01

注：*P<0.05，**P<0.01

2.3 免疫印迹检测细胞自噬情况

在自噬体形成过程中，细胞质中的LC3-I和磷脂酰乙醇胺(PE)偶联形成LC3-II，LC3-II定位于自噬体膜上，因而LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I比值与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。HepG2细胞在FGF19重组蛋白浓度为50 ng/mL和100 ng/mL时，处理24 h后LC3-II的表达量逐渐降低，但FGF19重组蛋白浓度为200 ng/mL时反而相较于FGF19重组蛋白浓度为100 ng/mL时LC3-II的表达量更多，表明100 ng/mLFGF19重组蛋白处理HepG2细胞能够更明显抑制LC3-II的表达。P62是自噬选择性底物，通过与LC3的相互作用定位于自噬体，而后被自噬-溶酶体系统降解，自噬功能的缺失将导致p62明显集聚。本研究结果显示，100 ng/mL FGF19重组蛋白处理HepG2细胞使p62明显集聚。在胃癌细胞中，同样可以观察到FGF19重组蛋白处理抑制LC3-II的表达(图5)。由此，我们可以得出结论，一定浓度的FGF19能够抑制肿瘤细胞自噬。

2.4 免疫荧光检测自噬情况

在对照组中，可以观察到正常生长24 h的HepG2细胞LC3斑点多于加入浓度为100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h后的细胞。此外，采用血清饥饿以及伊曲康唑诱导自噬，而加入FGF19重组蛋白共处理能够减少饥饿或者伊曲康唑诱导的LC3斑点(图6)。

图5不同浓度FGF19重组蛋白处理后细胞内LC3和p62的表达

注：A：浓度50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h时与对照组相比，肝癌细胞HepG2内LC3的表达情况以及浓度50 ng/mL和100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理24 h时与对照组相比，肝癌细胞HepG2内p62的表达情况；B：浓度25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的FGF19重组蛋白处理48 h时与对照组相比,胃癌细胞MKN45内LC3的表达情况

图6免疫荧光检测不同处理条件下HepG2细胞内LC3斑点的数量
注：处理时间24 h, FGF19浓度为100 ng/mL。 Starvation：血清饥饿；Itra:伊曲康唑

3 讨论

大量研究[13]表明，FGF/FGFR信号通路的失调将会导致肿瘤的发生发展，这已经在多种肿瘤细胞中被证实。FGFR4差别于FGFR1-3，在正常组织中仅在发育早期大量表达，在许多肿瘤组织内高表达，通过启动信号级联如STAT3、MAPK和PI3K/AKT等来调节细胞的增殖、分化和迁移[14]。FGF19作为FGFR4的配体，在N端具有一个约20个氨基酸大小的典型信号分泌序列，可以分泌到胞外与受体结合发挥作用[15]。

本研究中CCK8检测结果显示，当加入FGF19浓度<100 ng/mL时，随着FGF19浓度的增加，OD值愈大。但当药物浓度为200 ng/mL时，其OD值虽然比对照组数值大，却较药物浓度为100 ng/mL时更小。可以认为，FGF19重组蛋白浓度<100 ng/mL时，FGF19对肝癌HepG2细胞有明显的促进增殖作用，且与FGF19的浓度呈正相关，但超出了这个浓度时，其促增殖效果降低。本研究结果与Miura等[16]报道一致。

另一方面，100 ng/mL FGF19重组蛋白处理导致LC3-II表达降低及p62表达增强。在免疫荧光实验中，由于HepG2细胞自身的自噬水平有限，所以FGF19重组蛋白处理组与对照相比较，抑制LC3斑点的现象并不显著。因此，我们对细胞进行了饥饿及不同浓度伊曲康唑[17]处理，从而外源诱导细胞自噬。结果显示，在重组蛋白浓度为100 ng/mL时，FGF19能明显抑制肿瘤细胞内LC3斑点。在以肝癌细胞HepG2为模型得到一系列数据后，我们又用胃癌细胞MKN45重复进行以上实验过程，但因为胃癌细胞MKN45对FGF19的敏感度与肝癌细胞HepG2不同，故而设计的处理浓度及处理时间不同。但结果也表明，FGF19对胃癌细胞有明显促进增殖的作用，且浓度为25 ng/mL时，效果最显著。

综上所述，两种肿瘤细胞为模型的研究结果表明，一定浓度的FGF19可以促进肿瘤细胞的增殖，抑制其自噬。本研究探讨了FGF19调控肿瘤细胞增殖和自噬的生物学功能，明确了FGF19对肿瘤细胞增殖的促进作用。本研究还首次发现FGF19能够抑制肿瘤细胞自噬，为探索FGF19在肿瘤发生发展中的作用提供了新的思路。

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