肾炎消白颗粒对肾炎模型大鼠Nephrin蛋白表达的影响

曹尚美，黄雯静，王立范

1.漯河市中心医院，河南 漯河 462000 2.山东省莱芜市中医医院，山东 莱芜 271100 3.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036

蛋白尿是评估肾功能损害的一个最常用的指标，也是反应慢性肾脏病进展的重要标志物，肾小球过滤屏障的完整性取决于其3层结构(内皮、肾小球基底膜和足细胞)，肾小球高灌注、高滤过和肾小球滤过屏障的损坏都会导致蛋白尿[1]。足细胞在肾小球滤过屏障中是最后一道屏障，裂孔隔膜(SD)是肾小球足细胞-肾小球滤过屏障的主要部分，而电荷屏障被认为是定位于肾小球基底膜。研究显示肾小球疾病与Nephrin mRNA的减少有关，Nephrin mRNA水平可以作为反应肾小球疾病进展的标志[2]。有研究显示在阿霉素(ADR)诱导的肾病中，足细胞的损伤直接导致蛋白尿的产生，其作用机制可能与Nephrin蛋白的表达下调相关[3]。肾小球疾病的发病机制非常复杂，包括炎性细胞的浸润，肾小球细胞增殖，以及足细胞相关分子(如Nephrin或Podocin)的功能障碍[1]。

肾炎消白颗粒(SYXB颗粒)是根据张琪教授多年临床经验方研制而成，主要由土茯苓50 g，黄芪40 g，党参、山药、生薏苡仁、桑椹子、金樱子、菟丝子、牛膝各20 g，沙参、玄参各15 g，白茅根、白花蛇舌草各30 g，甘草10 g组成，对治疗肾小球肾炎蛋白尿有很好的疗效。本实验根据文献报道[4]采用一次性尾静脉注射ADR制备肾病蛋白尿模型。阿霉素肾病动物模型具有病变稳定，用药后3 h～56天肾组织可见明显超微结构改变；且蛋白尿持续时间长，可持续9个月以上；该模型还具有慢性进展性肾损害的特点，与人类进行性肾病表现类似，是研究蛋白尿与慢性肾脏疾病进展的最佳动物模型。本研究通过观察SYXB颗粒对阿霉素大鼠肾脏组织中Nephrin蛋白表达的影响，探讨其作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验动物 100只雄性Wistar大鼠购于北京维通利华实验技术有限公司，体质量180～200 g，生产许可证编号：SCXK(京2012-0001)，合格证号：No.11400700008581。动物实验通过动物伦理委员会的审批。动物实验在哈尔滨医科大学附属二院SPF级动物实验室进行，合格证号：SCXK(黑)2013-001，实验室的温度控制在(20±3)℃，湿度控制在60%左右。

1.2 实验药物 肾炎消白颗粒(黑龙江省中医医院药厂)规格：10 g，黑药制字 Z20090011，批号：130302。洛汀新(上海新亚药业闵行有限公司)规格：10 mg，国药准字H20044840，批号：120402。阿霉素(浙江海正药业公司)规格：10 mg，国药准字H33021980，批号：111201。

1.3 试剂和设备 DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。PV-600(兔抗鼠二抗)：北京中杉金桥生物技术有限公司。EDTA抗原修复液：北京中杉金桥生物技术有限公司。Nephrin兔抗大鼠多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司。病理切片机：美国Thermo HM340E，显微镜及摄像系统：日本OLYMPUS，数码病理图像分析系统MoticMed 6.0，尿白蛋白是由自动蛋白分析仪(SIEMENS BNTMII)进行检测，尿肌酐是由全自动生化分析仪(SIEMENS ADVIA2400)进行检测。

1.4 模型制备及分组 大鼠适应性喂养1周后，放置在室温(22±1)℃的空调室内，12 h照明，不间断给予自来水及含有18%蛋白质的标准大鼠饲料。100只Wistar雄性大鼠随机分为空白组(20只)和造模组(80只)，造模组一次性尾静脉注射ADR 6.5 mg/kg。3天后，用蛋白试纸测试大鼠尿液，空白组大鼠尿蛋白试纸条为黄色，证明蛋白尿为阴性，造模组大鼠尿蛋白试纸条为绿色或者橙色，证明蛋白尿为阳性，造模组大鼠又随机分为模型组、洛汀新组、中药低剂量组、中药高剂量组，每组20只。

1.5 给药方法 空白组、模型组灌胃蒸馏水2 mL/d，洛汀新组灌胃洛汀新0.90 mg/kg，中药高、低剂量组分别灌胃SYXB颗粒3.60、1.80 g/kg，每天1次，1周连续给药6次，共给药7周。

1.6 标本的采集 每周第7天清晨用代谢笼收集随机尿液，检测尿蛋白排泄量。第3、5周末各组分别选取3只大鼠处死取右肾，用4%多聚甲醛固定，以备免疫组化检测及光镜下对肾脏进行组织学检查。7周末大鼠处死后，取大鼠右肾，立即投入4%多聚甲醛中固定，以备免疫组化检测及光镜下对肾脏进行组织学检查。镜下观察以胞质或胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性反应，每张切片于皮质处随机选取5个视野，采用MoticMed 6.0病理图像分析软件，计算每个肾小球阳性信号平均面密度(细胞阳性表达面积与视野总面积百分比)。

1.7 免疫组化检测 ①石蜡包埋组织，制成4μm切片。②常规脱蜡失水。③将切片浸入EDTA抗原修复液(pH 8.0)中，微波炉中高温加热至沸腾后断电，间隔10 min，反复2次。④放入3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。⑤滴加按比例稀释的一抗(Nephrin兔抗大鼠多克隆抗体)，置入4℃冰箱过夜。阴性对照用PBS代替一抗滴加。⑥滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min。阴性对照用PBS代替二抗滴加。⑦选用DAB显色5～10 min，自来水充分冲洗。

1.8 病理切片观察 4%多聚甲醛固定肾脏，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm石蜡切片，按常规方法行HE染色，观察光镜下肾组织病理学改变。

1.9 统计学方法 用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料以(±s)表示，两两比较用q检验，各组及时间点比较用方差分析。

2 结果

2.1 一般情况 注射完阿霉素之后的大鼠，逐渐出现懒动、嗜睡，甚至牙齿掉落、毛发脱落等现象，毛发跟空白组相比没有光泽，后期伴有严重的腹水和消瘦。用SYXB颗粒治疗7周后，症状明显轻于模型组，与洛汀新组比较，中药高剂量组状态较好。

2.2 各组大鼠尿蛋白/肌酐比值比较 见表1。与空白组比较，模型组大鼠各时间点尿白蛋白/尿肌酐比值显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，洛汀新组大鼠各时间点尿白蛋白/尿肌酐比值显著降低，中药高剂量组大鼠在第3、4、5、6、7周尿白蛋白/尿肌酐比值显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与洛汀新组比较，中药高剂量组大鼠在第5、6、7周尿白蛋白/尿肌酐比值较低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠肾组织Nephrin蛋白表达比较 见表2，图1。各用药组中，Nephrin蛋白在第3周末表达上调，第5周末开始下调，而到第7周后表达上调，Nephrin蛋白的表达经历了一个先升后降再升的过程，最终在第7周末表达再次上调。与空白组比较，模型组大鼠各时间点肾组织Nephrin蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，洛汀新组、中药高剂量组大鼠各时间点肾组织Nephrin蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与第3周末比较，洛汀新组、中药高、低剂量组大鼠各时间点肾组织Nephrin蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠尿白蛋白/尿肌酐比值比较(±s) mg/g

表1 各组大鼠尿白蛋白/尿肌酐比值比较(±s) mg/g

与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05；与洛汀新组比较，③P＜0.05

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表2 各组大鼠肾组织Nephrin蛋白表达比较(±s)

表2 各组大鼠肾组织Nephrin蛋白表达比较(±s)

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与第3周比较，③P＜0.05

组 别空白组模型组洛汀新组中药高剂量组中药低剂量组第3周0.0 2 0±0.0 0 1 0 0.0 1 0±0.0 0 1 2①0.0 1 3±0.0 0 2 0②0.0 1 8±0.0 0 3 0②0.0 1 1±0.0 0 3 4第5周0.0 2 0±0.0 0 1 8 0.0 0 9±0.0 0 1 6①0.0 1 2±0.0 0 3 0②③0.0 1 5±0.0 0 2 0②③0.0 0 9±0.0 0 2 0③第7周0.0 2 0±0.0 0 1 3 0.0 0 7±0.0 0 2 3①0.0 1 4±0.0 0 2 0②③0.0 2 0±0.0 0 2 0②③0.0 1 6±0.0 0 2 5③

图1 各组大鼠肾脏组织中Nephrin表达结果 (×400)

2.4 各组大鼠7周内肾脏的病理学改变 见图2。光镜下对肾脏组织学的检查中，模型组大鼠肾脏表现为纤维组织增生，间质充血，肾小球出血，炎性细胞浸润，肾小管中出现蛋白管型、肾小管萎缩和肾小球萎缩、肿胀、变性的特征。第5周末，模型组大鼠出现节段硬化的情况，洛汀新组和中药低剂量组大鼠仍然有间质充血、肾小球肿胀和炎性细胞浸润的情况，中药高剂量组大鼠肾小球内有少量出血，间质内有少量炎性细胞浸润。第7周，模型组肾小球萎缩，伴有大量炎性细胞浸润，洛汀新组大鼠肾小球内仍有节段性硬化，中药高剂量组大鼠间质内有少量出血，中药低剂量组大鼠肾小管周围有纤维组织增生，肾小球内有蛋白管型，并伴有间质出血。

图2 各组大鼠7周内肾脏的病理学改变 (×400)

3 讨论

实验后期观察到模型组大鼠牙齿变黄浊，失去原有的光泽和透明度，甚至变脆易折断。《医述》曰“肾主骨，齿者骨之余，髓之所养，足阳明之支者，入于上齿，手阳明之支者，入于下齿若骨髓不足，阳明脉虚，则齿之诸病生矣；阳明实则齿坚牢，阳明虚则齿浮动。”慢性肾小球肾炎蛋白尿以脾肾虚损为本，肾虚髓枯，脾胃不充，齿失所养，故出现齿豁。实验后期中药高剂量组大鼠牙齿完整，表面光亮透明，较其它治疗组明显，分析此作用可能与SYXB颗粒中补脾肾药物有关，可通过补肾而使骨髓充养骨骼，补脾胃充实阳明而坚固齿龈，增强骨骼坚韧度。

慢性肾脏病是进展性疾病，不论病因如何，其肾组织结构改变常有一些共同点，基本形态学表现为毛细血管腔狭窄、闭塞缺血，肾小球玻璃样变性、硬化萎缩、数目减少，基底膜增厚，系膜细胞增殖，肾小管内大量蛋白管型，肾小管增粗或萎缩，结缔组织增生[5]。阿霉素肾病模型大鼠基本病理改变随病程进展，先后表现类似于人类微小病变型肾病、局灶节段性肾小球硬化症及肾小球硬化伴间质纤维化病变，实验室检查显示持续大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症等异常；大量蛋白尿已被证实是加重肾脏病理损伤的独立危险因素，随着大鼠蛋白尿的增多，肾脏病理改变逐渐加重[6]。

大量实验证明蛋白尿跟足细胞的损伤相关，足细胞裂孔隔膜是滤过蛋白的关键结构，Nephrin是足细胞膜结构上的关键蛋白，对膜稳定性起着主要的作用，足细胞的破坏跟此种基因的变化密切相关，足细胞损伤最先反应在足细胞因子的异常变化，有报道指出随着蛋白尿的增多，足细胞损伤后，足细胞因子Nephrin会随之变化，不同的时间点检测，肾皮质中足细胞因子含量也不同[7～9]。光镜下观察，3周末模型组大鼠表现为纤维组织增生，间质充血，肾小球出血，炎性细胞浸润，肾小管中出现蛋白管型、肾小管萎缩和肾小球萎缩、肿胀、变性的特征；第5周末，与第3周相比更加严重，模型组出现了肾小球局灶节段性硬化，光镜下发现肾小球有新月体的形成。经过7周治疗，中药组大鼠病理改变有所好转，以中药高剂量组大鼠最明显。由此可说明Nephrin蛋白的表达跟肾病的进展有着明确的联系，SYXB颗粒能上调Nephrin蛋白的表达。相关的研究发现，第5周时，光镜下显示，大鼠肾脏发生了硬化，产生了器质性病变，损伤已经无法恢复，没有正常数量的足细胞去表达基因，所以基因开始无法代偿性增加，转而下降[10]。也有研究显示基因的变化跟蛋白尿增多、足细胞的损伤、裂孔隔膜的破坏关系密切，而刚开始的第3周，正是肾脏早期代偿性增大的时间，已有报道显示肾病早期肾脏为了应付损伤会用增大来代偿损伤，所以增大的肾脏表达的Nephrin蛋白也会相应增多[11]。光镜下观察到，造模后的大鼠肾小球在第3周时出现肿胀变大，5周时模型组大鼠逐渐出现肾小球硬化和萎缩，第7周模型组大鼠情况仍然恶化，而各给药组大鼠肾小球肿胀和萎缩情况改善，以中药高剂量组改善最佳。所以第3周时Nephrin蛋白会增加，而第5周的时候蛋白表达下降，第7周给药组蛋白表达上升。课题组认为SYXB颗粒和洛汀新治疗后延迟了肾脏的这种损伤和硬化的程度，所以相比于模型组蛋白表达是略升高的，至于延迟这种损伤的机制，认为是SYXB颗粒和洛汀新减轻了大鼠的症状，提高了机体抗病的能力，保持了内环境的平衡，使得肾脏有更多的能量应付损伤，减慢了损伤的速度。

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