超声波辅助不同碱预处理对甘蔗渣酶解生成木糖含量的影响

崔媛媛，郑文静，许琳琳，刘容，孙卫东

(广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004)

甘蔗渣是制糖工业的重要副产品，是一种重要的可再生生物质资源。全世界每年甘蔗渣的产量大约为5.4×108吨。在中国广西，大约67%的蔗渣仍然用于锅炉燃烧发电和造纸[1]。甘蔗渣主要成分是半纤维素(19%～24%)、木质素(23%～32%)、纤维素(32%～48%)[2]。相对一般农作物秸秆农药残留量比较低，但木质化程度相对较高[3]。由于科学技术手段限制，甘蔗渣通常只用作燃料，其利用率低，并造成了环境的污染和资源的浪费。因为蔗渣的木质化程度高，蔗茎表皮存在硅化细胞，养分不协调等原因，作为反刍动物饲料和栽培菌类都受到限制[4]。但是随着对甘蔗渣等木质纤维素原料研究的不断深入，其丰富的来源、可观的产量和稳定的性质等优点，使其成为优良的生产原料。如何将丰富的甘蔗渣变成附加值高的产品是研究的热点。其中，甘蔗渣的半纤维素酶解糖化是重要的研究方向之一。

甘蔗渣的半纤维素酶解糖化过程是指利用半纤维素酶将半纤维素专一性地分解成单糖，单糖再经发酵生产木糖醇等高附加值的化工原料的过程。甘蔗中的半纤维素是以阿拉伯木聚糖形式为主[5]。一个木聚糖分子的完全酶解，首先是β-1,4-木聚糖酶作用于木聚糖分子内部的糖苷键将其水解成低聚木糖，然后β-木

糖苷酶开始作用于低聚木糖的尾端，可最终释放出木糖[6]。木糖经过发酵生成木糖醇。木糖醇具有良好的理化性质，广泛地被应用于食品、医药、化工等领域。

蔗渣的预处理和酶解糖化已经成为研究的热点，如何有效地使甘蔗渣生成可发酵糖是问题的关键[7]。蔗渣是典型的木质纤维素原料，结构中纤维素、半纤维素、木质素结合紧密，在利用甘蔗渣酶解生产木糖之前需要对其进行预处理，破坏致密结构，有利于化学试剂和酶的结合。预处理应该满足的要求是破坏半纤维素、木质素、纤维素紧密结合的结构，使木质纤维素的结构更松散，要避免碳水化合物的损失和生成对后续水解和发酵抑制作用的物质，同时还需要考虑成本因素。甘蔗渣等木质纤维素的原料的预处理方法一般分为物理法、化学法、生物法、物理化学结合法[8]。Xue L J等用H2O2-NaOH对蔗渣进行预处理，来实现对蔗渣中纤维素和半纤维素的分级利用。有机试剂如甘油用作预处理蔗渣，可以促进蔗渣的快速热解[9]。蒸汽爆破机械活化、蒸汽爆破、微波处理、超声波处理、高温分解等物理方法在木质纤维原料的预处理应用方面也都有大量的研究。超声波预处理一般会结合酸碱等化学方法，超声波的机械作用和空化作用会使木质纤维素原料大分子结构发生变化，但超声波对木质纤维素原料的微细结构的影响有限，所以超声波预处理常常会与其他方法联用预处理木质纤维素原料。舒雪梅等研究了超声波辅助碱预处理对甘蔗渣和王淋靓等[10]探讨了超声辅助碱性双氧水法预处理甘蔗渣，都证明了物理化学法的结合预处理甘蔗渣提高了蔗渣纤维对试剂的可及度和反应性能，极大缩短反应时间，提高反应效率。生物预处理是指利用微生物产生的酶专一高效分解木质纤维材料的大分子。但是生物预处理耗时较长，对反应条件高，目前还处于理论阶段。本文比较了超声波辅助单一碱和混合双碱预处理酶解甘蔗渣的效果，利用扫描电子显微镜分析预处理酶解前后表面形态。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

蔗渣原料取自广西防城港市糖厂，机械粉碎，过80目筛，备用。

氢氧化钠、氢氧化钙、氨水、氢氧化钾、盐酸、冰乙醇、木糖标准品：均为国产分析纯；木聚糖酶：分析纯，购自Sigma公司；间苯三酚：国产化学纯。

电动中草药粉碎机(WK-800A) 青州市精诚机械有限公司；电子天平(TLE204) 梅特勒-托利多仪器有限公司；数控超声波清洗机(KQ-500DE) 昆山市超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计(UV-1100) 上海美普达仪器有限公司；pH计(PHS-3E) 上海仪电科学仪器股份有限公司；数显恒温振荡器(SHA-CA) 常州普天仪器制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070A) 上海鸿都电子有限公司；低速自动平衡离心机(L550) 长沙湘仪离心机仪器有限公司；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ) 郑州长城科工贸有限公司；电热恒温水浴锅(HH-4) 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声波辅助NaOH溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，加入20 mL 10%的NaOH溶液，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.2 超声波辅助KOH溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，加入20 mL 10%的KOH溶液，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.3 超声波辅助氨水预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，加入20 mL 10%的氨水，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.4 超声波辅助Ca(OH)2溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，加入20 mL 10%的Ca(OH)2溶液，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.5 超声波辅助NaOH/KOH混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的NaOH溶液和10 mL 10%的KOH溶液，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.6 超声波辅助NaOH/氨水混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的NaOH溶液和10 mL 10%的氨水，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.7 超声波辅助NaOH/Ca(OH)2混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的NaOH溶液和10 mL 10%的Ca(OH)2，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.8 超声波辅助KOH/氨水混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的KOH溶液和10 mL 10%的氨水，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.9 超声波辅助KOH/Ca(OH)2混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的KOH溶液和10 mL 10%的Ca(OH)2，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.2.10 超声波辅助氨水/Ca(OH)2混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣

称取1.000 g甘蔗渣，分别加入10 mL 10%的氨水和10 mL 10%的Ca(OH)2溶液，在温度为60 ℃，功率为300 W条件下超声处理50 min，超声结束后，调节混合液pH至5.5，加入木聚糖酶0.050 g，置于恒温水浴振荡器中，55 ℃条件下反应18 h后灭酶活，4000 r/min离心15 min，抽滤，水解液稀释适当倍数后比色法测定木糖含量。

1.3 分析方法

木糖浓度测定：间苯三酚法测定木糖浓度。具体方法：蔗渣预处理酶解后离心抽滤，适当稀释后取1 mL，加入5 mL间苯三酚显色剂，摇匀后沸水浴显色8 min，流水冷却至室温后于波长554 nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白调零[11，12]。由标准曲线计算出木糖浓度。

1.4 扫描电镜(SEM)

分别将未做处理甘蔗渣、超声波辅助单碱预处理后甘蔗渣、超声波辅助双碱预处理后甘蔗渣、超声波辅助双碱预处理酶解糖化后甘蔗渣粘贴于导电胶板，喷金，电镜扫描。

2 结果与讨论

2.1 超声辅助NaOH单碱和混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣对木糖浓度的影响

经过预处理酶解后的甘蔗渣，分为固体和酶解液两个部分，酶解液中的主要成分是葡萄糖、木糖以及糠醛等其他发酵抑制产物。在利用木糖产木糖醇的过程中，木糖浓度越高，在利用微生物发酵生产木糖醇的过程中越有利，所以用木糖浓度作为预处理酶解甘蔗渣的指标。

图1 超声辅助NaOH单碱和混合碱溶液预处理对蔗渣酶解液中木糖浓度的影响Fig.1 The effect of ultrasonic assisted NaOH and mixed alkali pretrement on the xylose content of bagasse enzymatic hydrolysate

注：A为超声辅助NaOH溶液预处理酶解甘蔗渣， AB为超声辅助NaOH/KOH混合溶液预处理酶解甘蔗渣，AC为超声辅助NaOH/氨水混合溶液预处理酶解甘蔗渣， AD为超声辅助NaOH/Ca(OH)2溶液预处理酶解甘蔗渣。

由图1可知，超声辅助混合碱液预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度均高于超声辅助NaOH单碱预处理酶解效果，其中混合碱液预处理酶解甘蔗渣中木糖浓度AC>AB>AD。

甘蔗渣中主要成分为纤维素，半纤维素和木质素，是比较典型的木质纤维素原料，木质纤维素原料中纤维素紧密结合木质素和半纤维素，使反应试剂难以到达纤维素表面和扩散入纤维素内部，所以影响甘蔗渣酶水解的效率主要因素是木质纤维素可及表面积，结晶度，聚合度。超声波，是指频率一般为20000 Hz的声波，超声波处理可以打开甘蔗渣纤维素的结晶区，将分解木质素大分子，极大提高可及表面积和化学反应的性能，但是超声波处理对甘蔗渣微细结构的影响有限。而NaOH中OH-能破坏甘蔗渣中半纤维素和木质素之间的醚键，同时也能消弱半纤维素和纤维素之间的连接的氢键，通过皂化半纤维素和木质素之间的酯键，从而增大甘蔗渣纤维间的孔隙，使木聚糖酶对半纤维素的可及性增加，从而提高半纤维素的酶解率。同时NaOH中的Na+有空轨道，可以结合半纤维素分子中β-1，4-糖苷键上的氧原子上的孤对电子，从而减弱β-1，4-糖苷键，有利于酶水解反应的进行[14]。半纤维素结构包括戊糖基、乙酰基等有支链的易水解多聚糖，氨水预处理酶解甘蔗渣，可以去除木质素及抑制发酵生产的乙酸，为之后微生物发酵木糖醇提供有利条件。由图1可知，超声波辅助混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣木糖浓度均比单一NaOH溶液预处理酶解高，其中超声波辅助NaOH/氨水混碱预处理酶解甘蔗渣木糖浓度提高达45%以上，超声波辅助NaOH和氨水混碱预处理酶解甘蔗渣可以大大提高酶水解液中木糖浓度。木糖浓度的提高极有利于之后微生物发酵木糖生产木糖醇的过程。

2.2 超声辅助KOH单碱和混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣对木糖浓度的影响

图2 超声辅助KOH单碱和混合碱溶液预处理对蔗渣酶解液中木糖浓度的影响Fig.2 The effect of ultrasonic assisted KOH and mixed alkali pretrement on the xylose content of bagasse enzymatic hydrolysate

注：A为超声辅助KOH溶液预处理酶解甘蔗渣，BA为超声辅助KOH和NaOH溶液预处理酶解甘蔗渣，BC为超声辅助KOH和氨水预处理酶解甘蔗渣，BD为超声辅助KOH/Ca(OH)2溶液预处理酶解甘蔗渣。

由图2可知，超声辅助混合碱液预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度均高于超声辅助KOH单碱预处理酶解效果，其中混合碱液预处理酶解甘蔗渣中木糖浓度BC>BA>BD。

半纤维素的水解与甘蔗渣中木质素去除有关，碱液能有效去除甘蔗渣中木质素，增大甘蔗渣表面可及表面积，KOH属于强碱溶液，OH-能破坏甘蔗渣中半纤维素、木质素、纤维素之间形成的紧密结构，打开从而增大甘蔗渣纤维间的孔隙，使木聚糖酶对半纤维素的可及性增加，结合超声波预处理进一步提高半纤维素的酶解率。由图2可知，超声波辅助KOH溶液预处理酶解甘蔗渣，水解液中木糖含量较高，达1.5954 g/L，KOH结合其他碱液处理酶解甘蔗渣木糖含量同样也得到提高，增长率达18%以上。相比较NaOH混合碱液预处理酶解甘蔗渣，木糖浓度增长率并没有明显的提高，KOH市场价格相较于NaOH昂贵，并不有利于进一步发酵生产木糖醇。

2.3 超声辅助氨水单碱和混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣对木糖浓度的影响

图3 超声辅助氨水单碱和混合碱溶液预处理对蔗渣酶解液中木糖浓度的影响Fig.3 The effect of ultrasonic assisted ammonium hydroxide and mixed alkali pretrement on the xylose content of bagasse enzymatic hydrolysate

注：C为超声辅助氨水预处理酶解甘蔗渣，CA为超声辅助氨水/NaOH溶液预处理酶解甘蔗渣，CB为超声辅助氨水和KOH预处理酶解甘蔗渣，CD为超声辅助氨水/Ca(OH)2溶液预处理酶解甘蔗渣。

由图3可知，超声辅助混合碱液预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度均高于超声辅助氨水单碱预处理酶解效果，其中混合碱液预处理酶解甘蔗渣中木糖浓度CA>CB>CD。

甘蔗渣中半纤维素和木质素之间存在酯键，在OH-条件下发生皂化反应，破坏半纤维素和木质素之间结构。NaOH中的Na+有空轨道，可以结合半纤维素分子中β-1,4-糖苷键上的氧原子上的孤对电子，从而减弱β-1,4-糖苷键，有利于酶水解反应的进行。在氨水作用下，可以去除甘蔗渣木质纤维素结构中乙酰基，润胀作用破坏其紧密结合结构，打开纤维素的结晶区，去除大量木质素，有效增大甘蔗渣木质纤维素结构的可及表面积，使酶具有更好的可及性。混合碱液结合超声波作用断裂甘蔗渣木质纤维素中大分子化学键，同时超声波热效应使原料表面形态结构发生变化，从而提高酶水解液中木糖浓度，为进一步进行的微生物发酵木糖醇过程提供良好的原料。由图3可知，超声波辅助氨水/NaOH混合碱液预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度较高，且其中氨水价格低廉，氨水易挥发，可以循环重复利用，所以是一种理想的预处理酶解甘蔗渣的方法。

2.4 超声辅助Ca(OH)2单碱和混合碱溶液预处理酶解甘蔗渣对木糖浓度的影响

图4 超声辅助Ca(OH)2单碱和混合碱溶液预处理对蔗渣酶解液中木糖浓度的影响Fig.4 The effect of ultrasonic assisted Ca(OH)2 and mixed alkali pretrement on the xylose content of bagasse sugarcane enzymatic hydrolysate

注：D为超声辅助氨水预处理酶解甘蔗渣，DA为超声辅助Ca(OH)2/NaOH混合溶液预处理酶解甘蔗渣，DB为超声辅助Ca(OH)2/KOH预处理酶解甘蔗渣，DC为超声辅助Ca(OH)2/氨水预处理酶解甘蔗渣。

由图4可知，超声波辅助混合碱液预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度均高于超声波辅助Ca(OH)2单碱预处理酶解效果，其中混合碱液预处理酶解甘蔗渣中木糖浓度DC>DB>DA。

超声波辅助Ca(OH)2预处理酶解甘蔗渣后木糖浓度较高，主要原因是Ca(OH)2属于二元强碱，OH-能破坏甘蔗渣中半纤维素、木质素和纤维素之间形成的紧密的结构，打开从而增大甘蔗渣纤维间的孔隙，使木聚糖酶对半纤维素的可及性增加，结合超声波预处理进一步提高半纤维素的酶解率。但是Ca(OH)2微溶于水，不利于预处理酶解甘蔗渣的进行。超声波辅助Ca(OH)2及混合碱液预处理酶解甘蔗渣实验过程中，由于Ca(OH)2微溶于水，使酶水解液固液分离困难，不利于进一步微生物发酵木糖醇的进行。

2.5 甘蔗渣结构表征分析

图5 不同预处理后的蔗渣SEM图Fig.5 The SEM images of different pretreatment of sugarcane bagasse

注：(a)为原蔗渣，(b)为NaOH预处理的蔗渣，(c)为NaOH/氨水预处理的蔗渣，(d)为NaOH/氨水预处理并酶解后的蔗渣。

由图5可知，2000倍的扫描电镜图中可以观察到，未做预处理的甘蔗渣表面光滑，组织保持完整。这样排列紧密有序的结构没有给酶提供足够的接触面积，所以未经过预处理的蔗渣不能有效地酶解。超声波辅助NaOH预处理的甘蔗渣，表面多孔、结构卷曲松散；超声辅助NaOH/氨水预处理甘蔗渣表面出现褶皱、多层次和“沟渠”，比表面积增大有利于提高甘蔗渣酶解水解反应的可及性。超声波辅助NaOH/氨水预处理且酶解后的甘蔗渣，结构松散，出现碎屑，木质纤维素结构被破坏程度高，说明经过超声波辅助双碱预处理的蔗渣已经被有效地酶解。

3 结论

以木糖浓度为指标，考察了超声波辅助NaOH、KOH、氨水、Ca(OH)2及混合双碱溶液预处理酶解甘蔗渣对木糖浓度的影响，得出超声波辅助混合双碱液处理结果更佳，其中超声波辅助NaOH和氨水混合碱液预处理酶解甘蔗渣木糖浓度最高，木糖浓度达1.928 g/L。

通过对预处理前后甘蔗渣形态结构分析，超声波混合双碱预处理之后的甘蔗渣表面出现褶皱和“沟渠”，疏松多孔，甘蔗渣的比表面积增大，有利于甘蔗渣反应的可及性，说明采用超声波辅助NaOH和氨水的方法预处理，能够实现蔗渣的有效酶解。半纤维素酶解生成的木糖可以进一步发酵生成木糖醇，木糖醇在食品、医药、工业等方面应用广泛，从而实现了木质纤维材料的高值化利用。在此基础上，蔗渣中剩余的纤维素和木质素进一步的开发利用也有待探究。

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