飞龙掌血提取物对高脂血症心肌缺血大鼠炎症因子的影响

刘 明，刘 杨，邓 颖，胡祖林

(1.贵阳中医学院基础医学院，贵阳 550025； 2.国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550002)

据统计，心血管疾病已经成为一个世界性的影响社会各经济群体的健康问题，2015年全球约有1792万人死于心血管疾病[1]。动脉粥样硬化是心血管疾病的根本原因，脂质代谢异常是动脉粥样硬化最重要的危险因素[2]。大量研究表明，炎症因子(TNF-α、IL-6等)在高脂血症和心血管疾病的发展中起到重要的诱导作用，调控炎症反应是心血管疾病治疗的一种可靠、有效的手段[3-4]。

飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血ToddaliaasiaticaLam.的根或根皮，为贵州苗族习用药材[5]。药理研究表明其具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗病毒、保护心肌等作用[6-7]。因此，飞龙掌血显示潜在的对心血管疾病的治疗作用。本研究利用高脂血症复合心肌缺血大鼠模型，观察飞龙掌血对高脂血症心肌缺血大鼠血脂和炎症因子的影响，并分析可能的机制，为进一步应用飞龙掌血治疗心血管疾病提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，8周龄，购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心[SCXK(军)2014-0011]。动物饲养于贵州省实验动物工程技术中心[SYXK(黔)2012-0001]，饲养环境：温度(23±1)℃和湿度(55±2)%，自由进食，每日光照/黑暗各12 h，经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(编号1509005)。

1.2 实验药物和试剂

飞龙掌血提取物(TAE)是由飞龙掌血根皮提取获得(飞龙掌血根皮购自贵阳市药材市场，加8倍70%乙醇回流提取2次，滤液经水沉淀后，浓缩干燥，提取率为10%)，临床人日用生药量为10～30 g，本研究依据预实验结果拟定人日用生药量为12 g，折算为提取物为1.2 g；辛伐他汀片(每片10 mg)，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司；盐酸异丙肾上腺素注射液(1 mg/mL)，上海禾丰制药有限公司；TC、TG、LDL、HDL试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所；TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10试剂盒，均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验仪器

MS-200生物信号记录仪，成都泰盟科技有限公司；TGL-12 GB-C台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；721分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；ZS-3型酶标仪，北京新风机电厂；RM2015石蜡切片机，德国莱卡；BX51T-PHD-J11显微镜，日本奥林巴斯。

1.4 实验方法

1.4.1 高脂血症大鼠模型建立及分组、给药

参照文献方法[8-9]造模：高脂血症组大鼠每天以高脂饲料(组成: 3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、80.8%基础饲料)喂养，空白组以基础饲料喂养，4周后对照组与高脂血症组随机取3只大鼠检测血脂4项，高脂血症组血脂指标与空白组相比较具有明显区别，则说明模型制备成功。

选取体重相近的造模动物继续喂饲高脂饲料，并随机分成模型组(model)、辛伐他汀组(SVTT，3.5 mg/kg)，飞龙掌血提取物高、低剂量组(TAE，280、70 mg/kg)及对照组(control)，每组10只。灌胃给予相应的药物，10 mL/kg，每天一次，连续4周，对照组与模型组灌胃等容积蒸馏水。

1.4.2 心肌缺血模型建立

参照文献方法[6,10-11]造模：于末次给药前72 h，除对照组外，于灌胃给药30 min后，各组动物皮下注射Iso 4 mg/kg，对照组给予等容量的生理盐水，连续3次，每间隔24 h，诱发冠状动脉痉挛心肌缺血。

1.4.3 观察指标及检测

第3次皮下注射Iso前，大鼠用1%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉，与MS-200生物信号记录仪相连，先描记一段注射Iso前的心电图，然后皮下注射Iso，记录30 min的Ⅱ导联心电图。主要观察阳性标准T波和ST段，参照文献标准[11]，具备以下条件之一者即可判断为心肌缺血阳性，①心电图ST段水平上抬或向下偏移>0.1 mV；②T波高耸超过同导联R波的1/2及以上者。每间隔10 min记录一次大鼠Ⅱ导联心电图，共记录30 min，分别测量Ⅱ导联在各时刻ST段偏移的幅度，计算各组Ⅱ导联注射Iso前与注射Iso后各时刻ST段偏移幅度的差值△ST(mV)。

上述检测完成后，腹主动脉取血，3500 r/min离心15 min，取上清液，每组随机选取8个样本按照试剂盒说明书操作，检测血清TC、TG、LDL、HDL、TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10含量。

取心脏、肝脏，生理盐水清洗，滤纸吸干水，称重；剥离生殖器及肾周围的脂肪，称取脂肪的重量，计算脏器指数。脏器指数(g/100 g)=脏器重÷体重×100。

每组随机取6只动物心脏，4%多聚甲醛固定，进行切片制作，HE染色，显微镜下观察心肌组织病理变化。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 心电图变化

模型组大鼠S-T段缺血改变明显，各时刻ST段偏移幅度的差值显著增加；与模型组相比，TAE高、低剂量组均能明显改善大鼠心肌缺血变化，各时刻ST段偏移幅度的差值显著下降(P< 0.05)。如表1、图1所示。

2.2 脏器指数的变化

结果显示模型组大鼠的脏器指数显著升高；与模型组相比，TAE高、低剂量组能显著降低心脏指数、脂肪指数，TAE高剂量组能明显降低肝脏指数(P< 0.05)。如表2所示。

2.3 血脂水平的变化

模型组大鼠血清TC、TG、LDL含量显著升高，血清HDL含量明显降低；与模型组相比，TAE高、低剂量组能显著降低血清TC、TG、LDL含量，TAE高剂量组能升高血清HDL含量(P< 0.05)。如表3所示。

2.4 炎症因子的变化

模型组大鼠血清TNF-α、INF-γ、IL-6含量显著升高，血清IL-10含量明显降低；与模型组相比，TAE高、低剂量组能显著降低血清TNF-α、INF-γ、IL-6含量，TAE高、低剂量组能升高血清IL-10含量(P< 0.05)。如表4所示。

表1 对模型大鼠心电图的影响

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

图1 对模型大鼠心电图的影响Fig.1 Effects of TAE on electrocardiogram of the model rats

组别Groups剂量(mg/kg)Doses心脏指数Heartindex肝脏指数Liverindex脂肪指数Fatindex对照组Controlgroup—0.371±0.069**3.032±0.391**1.742±0.171**模型组Modelgroup—0.499±0.0764.169±0.4282.640±0.141辛伐他汀组SVTT3.50.423±0.059*3.817±0.373*1.909±0.176**飞龙掌血组TAE2800.418±0.075*3.784±0.445*1.999±0.192**700.426±0.069*3.921±0.4462.246±0.178**

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 对模型大鼠血清TC，TG，LDL，HDL含量的影响

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 对模型大鼠血清TNF-α，INF-γ，IL-6，IL-10含量的影响

注：与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

图2 对模型大鼠心肌组织病理形态的影响(HE×100)Fig.2 Effects of TAE on the pathological changes of myocardial tissue in the model rats. HE staining.

2.5 心肌组织病理变化

对照组大鼠的心肌组织结构正常，心肌纤维排列整齐，没有变性、坏死、肥大、萎缩的病变。模型组大鼠注射Iso后，引起了心肌损伤，有大片坏死灶，肌纤维排列紊乱、坏死细胞质溶解以及水肿。与模型组相比，TAE高、低剂量组大鼠心肌组织病变的程度明显减轻。如图2所示。

3 讨论

在制备高脂血症动物模型中，给动物喂饲高脂饲料是最为常用的方法。尽管高脂饲料造模存在诸如饲料过于油腻而影响动物的进食，饲料损耗大，成本较高，且油脂对整个实验环境也造成一定的污染等缺点，但长期高脂饮食制备高脂血症是最符合人类高脂血症形成特点，因此，高脂饲料制备高脂血症动物模型依然是目前实验研究中最常用的造模方法。本研究结果表明，给大鼠进行高脂饲料喂饲4周，即可形成高脂血症，继续喂饲高脂饲料致8周时，大鼠血清TC、TG、LDL含量显著升高，血清HDL水平明显下降，肝脏、脂肪指数显著升高，经飞龙掌血治疗后，血清TC、TG、LDL含量明显降低，血清HDL水平显著升高，肝脏、脂肪指数明显下降，表明飞龙掌血对高脂饲料引发的大鼠高脂血症具有显著的抑制作用。

近年研究发现，90% 以上的缺血性心脏病是由于冠状动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)引起的，高脂血症是AS的重要促进因素[12]。随着AS炎症学说的提出，人们逐渐认识到冠心病心肌缺血是一个炎症性疾病过程，炎症被认为是AS的核心发病机制，参与了AS从发生到发展以及恶化的所有病理过程[13]。大量临床观察也都证明炎症因子水平与高脂血症有着密切的联系[14]。因此，通过降血脂及抗炎性损伤预防和治疗心血管疾病已经成为目前的研究热点。大量研究表明，高脂血症产生的大量脂肪细胞可以诱导巨噬细胞的活化，进而分泌炎症因子如IL-6，引起高TG血症，造成潜在的心血管疾病风险；脂肪细胞也可以诱导T淋巴细胞的活化，进而分泌炎症因子如INF-γ，分泌的INF-γ可进一步促进巨噬细胞的活化，分泌IL-1β，并联合IL-1β共同刺激巨噬细胞分泌IL-6，加重炎症反应和高脂血症心肌损伤，形成恶性循环[15]。另一方面，活化的T淋巴细胞会调节IL-10等的分泌，抑制IL-6的生理活性，减轻炎症反应，达到动态平衡[16]。本研究结果显示，飞龙掌血对高脂血症心肌缺血大鼠具有保护作用，表现为大鼠心脏指数显著降低，明显改善心电图S-T段，降低血清TNF-α、INF-γ、IL-6水平，升高血清IL-10水平，改善心肌组织病理损伤，说明飞龙掌血通过调节抗炎与促炎因子的平衡，减轻心肌缺血损伤，保护心肌细胞。

本研究对飞龙掌血提取物降血脂、抗心肌缺血和抗炎性损伤的作用机制做了初步的探讨，发现飞龙掌血提取物可有效降低高血脂和改善心肌缺血损伤，调节抗炎与促炎因子平衡，为进一步开发利用飞龙掌血植物资源和研制新药提供了实验依据和理论基础。

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