通心络对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞损伤的保护作用

位庚 曹柳 张苏明 侯凤英 赵玉莎 何素彦

[摘要] 目的 探討通心络对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs）损伤的干预作用及其相关机制。 方法 用高糖培养基建立细胞损伤模型，采用随机数字表法将HRCECs分为正常对照组（normal组）、模型组（model组，30 mmol/L葡萄糖）、通心络低剂量组（TXL-L组，100 μg/mL通心络）、通心络中剂量组（TXL-M组，200 μg/mL通心络）、通心络高剂量组（TXL-H组，400 μg/mL通心络）。检测各组细胞生存活性，细胞上清液内皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）和细胞间黏附因子-1（ICAM-1）含量，以及细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和核转录因子-κB（NF-κB）的蛋白表达情况。 结果 与normal组比较，model组细胞生存活性明显降低，细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量升高，细胞eNOS蛋白表达下调，NF-κB蛋白表达上调（P < 0.01）;与model组比较，TXL-M组和TXL-H组细胞上清液ET-1含量明显减少（P < 0.01），TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞上清液IL-6和ICAM-1含量明显减少，eNOS蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达下调（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 通心络可明显改善高糖诱导的HRCECs损伤，并通过减轻炎症损伤发挥细胞保护作用。

[关键词] 通心络;人视网膜微血管内皮细胞;高糖;炎症

[中图分类号] R774;R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2018）12（c）-0012-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effects and related mechanism of Tongxinluo on high glucose-induced human retinal capillary endothelial cells （HRCECs） injury. Methods The cells damaged model was established with high glucose. The HRCECs were divided into normal group， model group （30 mmol/L glucose）， Tongxinluo low dose group （TXL-L group， 100 μg/mL Tongxinluo）， Tongxinluo middle dose group （TXL-M group， 200 μg/mL Tongxinluo） and TXL high dose group （TXL-H group， 400 μg/mL Tongxinluo） by random number table method. The cell viability， contents of endothelin （ET）-1， interleukin （IL）-6 and intercellular adhesion molecule （ICAM）-1 in supernatant， and the endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and nuclear factor （NF）-κB protein expression in cells of each group were detected. Results Compared with normal group， the cell viability was significantly decreased， the contents of ET-1， IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly increased， the protein expression of eNOS was significantly down-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly up-regulated in model group （P < 0.01）. Compared with model group， the contents of ET-1 in supernatant were significantly decreased in TXL-M group and TXL-H group （P < 0.01）， and the contents of IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly decreased， the protein expression of eNOS was significantly up-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly down-regulated in TXL-L group， TXL-M group and TXL-H group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Tongxinluo can signifcantly improve high glucose-induced HRCECs injury， and plays a role in cell protection through reducing inflammatory injury.

[Key words] Tongxinluo; Human retinal capillary endothelial cells; High glucose; Inflammation

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）为糖尿病最为严重的微血管并发症之一，已成为成年人致盲的主要原因，并且发病率还在逐年增加。高血糖被认为是导致DR的重要因素，持续高血糖诱发的视网膜组织中微血管内皮细胞损伤是DR出现血管病理改变的始动因素[1]。中药复方制剂通心络胶囊，在中医络病理论指导下研制而成，对微血管有较好的保护作用[2-4]。已有临床研究显示，通心络对DR有较好的治疗作用[5-6]，但其对视网膜微血管的作用机制尚不十分清楚。本研究选用人视网膜微血管内皮细胞（human retinal capillary endothelial cells，HRCECs）为研究对象，高糖诱导HRCECs损伤，模拟人体内高糖环境对视网膜微血管的影响，观察通心络对该损伤的干预作用及其作用机制，为通心络应用于DR的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验用细胞

HRCECs购自美国ScienCell公司。

1.2 药物及试剂

通心络药粉由石家庄以岭药业股份有限公司提供（批号：S-130901）;内皮细胞培养基（endothelial cell medium，ECM）（美国ScienCell公司，批号：1001）;CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所，批号：KN868）;内皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20160804、20150916、20160808）;内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体及核转录因子-κB（NF-κB）p65抗体（美国Abcam公司，批号分别为ab76198、ab16502）。

1.3 主要仪器

Effendrof Centrifuge 5804R离心机（德国Effendrof公司）;YP502N电子天平（上海菁海仪器有限公司，读数精度：0.01 g）;多功能酶标仪（美国Bio Tek公司）;UVP凝胶扫描系统（美国UVP公司）;电转膜仪、半干转膜仪、垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 药物配制

1.5 细胞分组及处理

采用随机数字表法将细胞分为以下五组（每组平行设置3～4个复孔）：①正常对照组（normal组），正常培养;②模型组（model组），含30 mmol/L葡萄糖的ECM无血清培养基培养;③通心络低剂量组（TXL-L组），含通心络100 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h后，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络100 μg/mL的无血清ECM培养基;④通心络中剂量组（TXL-M组），含通心络200 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h后，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络200 μg/mL的无血清ECM培养基;⑤通心络高剂量组（TXL-H组），含通心络400 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络400 μg/mL的无血清ECM培养基。以上五组细胞处理完毕后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h后进行指标检测。

1.6 CCK-8法檢测HRCECs生存活性

接种于96孔细胞培养板的HRCECs按照“1.5”项处理后，吸弃原培养基，每孔加入含CCK-8的无血清ECM培养基100 μL，放入细胞培养箱中继续孵育1 h后，酶标仪检测450 nm波长处OD值[8]。以各组OD值与normal组的比值行统计分析。

1.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测HRCECs上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量

接种于96孔细胞培养板的HRCECs按“1.5”项处理后，收集各组细胞上清液，1.5 mL无菌EP管中1000 r/min（r = 8.7 cm）离心2 min取上清液。ELISA法检测各组细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1的含量，实验中操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 Western blot法检测eNOS和NF-κB蛋白表达

接种于直径为6 cm细胞皿的HRCECs按“1.5”项处理后，培养皿内加入40 μL细胞裂解液于冰上充分裂解，超声破碎后放入离心机内离心，收集上清液，蛋白定量后取等量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，封闭液中封闭，一抗孵育，二抗孵育，以GAPDH作为内参，将各目的蛋白吸光度值与GAPDH吸光度值的比值进行统计学分析。

1.9 统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时，采用最小显著差法（LSD），若方差不齐，采用Dunnett′s T3法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人视网膜微血管内皮细胞生存活性和细胞上清液中ET-1、IL-6、ICAM-1含量比较

与normal组比较，model组细胞生存活性明显降低，细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量明显升高（P < 0.01）;与model组比较，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞生存活性明显升高，细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显降低，TXL-M组和TXL-H组细胞上清液中ET-1含量明显降低（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组人视网膜微血管内皮细胞eNOS和NF-κB蛋白表达比较

与normal组比较，model组细胞eNOS蛋白表达明显下调，NF-κB蛋白表达明显上调（P < 0.01）;与model组比较，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞eNOS蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达明显下调（P < 0.05或P < 0.01）。见表2、图1。

3 讨论

DR是糖尿病最常见和严重的微血管并发症之一，其基本的病理改变为微血管内皮细胞损伤、基底膜增厚、内皮细胞增生、新生血管形成等[9]，后期可形成微血栓甚至引起微血管闭塞[10]。这些微血管的病变属于中医“络病”理论研究的范畴，治疗上应以化瘀通络为主，通心络是在中医络病理论指导下组方而成，由人参、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、赤芍、酸枣仁等药物组成，具有化瘀通络、益气活血等功效。实验证实，通心络具有降脂、抗炎、保护血管内皮细胞、抑制内皮细胞凋亡等作用[11-12]。已有动物实验证实，通心络对KK/Upj-Ay小鼠视网膜组织具有保护作用[13]，亦有临床试验表明通心络治疗DR效果确切。

本研究选用高糖诱导HRCECs损伤作为研究糖尿病视网膜微血管病变的模型，高糖能降低HRCECs的生存活性，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组均能升高HRCECs的生存活性，生存活性的提高是保证血管内皮细胞发挥正常功能的基础条件，说明通心络对糖尿病视网膜微血管病变具有一定的防治作用。一氧化氮（NO）对血管有保护作用，参与维持血管的正常张力，为内皮细胞合成的主要舒血管物质，它的前体是L-精氨酸，由一氧化氮合酶（NOS）催化合成，内皮细胞中存在的是eNOS，由于NO具有不稳定性，故本研究检测eNOS的蛋白表达以间接反映NO的含量。ET-1主要由内皮细胞合成和释放，具有收缩血管的作用[14]。在生理状态下，NO和ET-1的含量在局部保持动态平衡。本研究发现高糖诱导HRCECs后，细胞上清液中ET-1含量明显升高，细胞eNOS蛋白表达明显下调，说明NO和ET-1之间的平衡状态被打破，内皮细胞功能受到了损伤，通心络不同剂量干预后，细胞上清液中ET-1含量明显降低，细胞eNOS蛋白表达明显上调，且呈现剂量依赖性，提示通心络对HRCECs的分泌功能起到了保护作用。

DR的发生机制与持续性高血糖、炎性反应、氧化应激、血管内皮细胞凋亡等因素相关，近年来研究发现，炎症在DR的发生发展过程中起到了重要的作用，该观点的提出为治疗DR提供了新方向[15]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β和ICAM-1等多种炎症因子之间的相互作用影响了DR的发展。IL-6作为前炎症因子，在炎性反应中起着重要的作用[16]，ICAM-1是主要的黏附分子，在血管内皮细胞损伤过程中可释放自由基、细胞因子，亦有研究显示内皮细胞的损伤或死亡部分继发于ICAM-1介导白细胞黏附于视网膜血管。NF-κB是细胞内调节炎症信号转导的关键因子之一，能够调控包括IL-6和ICAM-1在内的多种炎性细胞因子的基因转录表达[17]。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-κB可上调黏附分子的表达，使白细胞瘀滞、黏附于视网膜血管，引起一系列视网膜病变。本研究中，model组细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显升高，细胞NF-κB蛋白表达明显上调，通心络不同剂量干预后，细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显降低，细胞NF-κB蛋白表达明显下调。提示通心络能够抑制高糖诱导HRCECs损伤炎性因子的高表达可能是通过抑制NF-κB途径实现的。

高效液相色谱和气相色谱的指纹图谱技术已经证实，通心络胶囊的主要成分为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、芍药苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B等。有研究表明，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对内皮细胞具有显著的保护作用[18-19]，而芍药苷可减轻内皮细胞的炎性反应[20]。所以本研究推测，通心络对HRCECs的功能受损和炎性反应的保护作用与此相关，但通心络中是何成分起主要作用还需进一步研究。

综上所述，高糖可诱导HRCECs发生功能障碍及炎性反应，通心络可抑制该过程，其作用机制可能与通心络抑制NF-κB介导的炎性反应有关。

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（收稿日期：2018-02-02  本文编辑：张瑜杰）