探索不同培养条件对大肠杆菌表达蛋白的影响*

白子上 曹湜欧 吴重玺 范家齐 和 渊

（中国人民大学附属中学 北京 100080）

1 研究背景

随着基因工程技术日趋成熟，利用基因重组技术构建生物工程菌发酵工艺获得产品是当前的发展趋势，其目的是为了获得大量的外源基因产物。外源基因的高水平表达受到其所处的环境条件影响，本实验主要研究了诱导时间、诱导温度和诱导剂IPTG 浓度对于蛋白表达的影响。

诱导开始时间的选择和诱导时长对于目的蛋白的表达水平有重要影响。在大肠杆菌在菌体生长的对数早期进行诱导，菌体量较少，表达量有限。在对数晚期进行诱导，由于营养的消耗及代谢物的积累，菌体生长受到抑制，表达量也有所下降。因此，通常选择大肠杆菌细胞量OD600为0.6～0.8 左右时开始诱导，细菌处于比较理想的状态［1］，此后加入诱导剂后的表达时间需要进行摸索才能使表达量优化到最佳的水平。

诱导剂的浓度对大肠杆菌蛋白的表达也可能存在影响。操纵子是基因表达和调控的单元，主要见于原核生物的转录调控［2］。用乳糖或者其类似物（例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）可以体外启动基因的表达，因此作为一种诱导外源基因表达的诱导剂被实验室广泛使用。

温度是影响工程菌生长、 质粒稳定性和重组产物形成的重要因素。大肠杆菌的最适生长温度为37℃左右，然而在较高温度下，细菌的生长速率较高导致发酵过程中易积累大量代谢副产物，从而对菌体生长和目的蛋白的表达产生抑制［2］。

本实验通过对不同诱导剂浓度下重组大肠杆菌蛋白PYL10 的表达，探索诱导剂浓度对蛋白表达的影响。

2 材料与方法

2.1 实验材料 大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21（DE3），PYL10 表达质粒，LB 液体培养基，LB平板，氨苄青霉素，IPTG，考马斯亮蓝R-250；蛋白电泳液，脱色液，超净工作台，酒精灯，涂布器，微量移液器，锥形瓶，铝箔纸，一次性手套，涡旋混合器，离心机，紫外可见光分光光度计，超声破碎仪，天平，计时器，台式恒温振荡器，恒温振荡培养箱，镍-纯化层析柱，蛋白质电泳仪。

2.2 实验步骤

2.2.1 目的基因的转化 取100 μL 冰上融化的BL21（DE3）感受态细胞于洁净的1.5 mL 离心管中，加入PYL10 表达质粒2 μL，用微量移液器轻轻吹吸至完全混匀，冰浴25 min。42℃水浴热激90 s 后，迅速放回冰上静置2 min，此步骤应减少晃动，以免转化效率降低。在超净工作台内进行操作，加入700 μL 未添加抗生素的LB 液体培养基，用加样枪轻轻吹吸至混匀，置于恒温振荡培养箱中以37℃，200 r/min，复苏60 min。用离心机以5 000 r/min 离心1 min，留取100 μL 左右上清，用移液枪轻轻吹打重悬细胞。用移液枪在含有100 μg/mL 的LB 固 体 平 板 上 加 入8 μL IPTG 和40 μL X-gal，用涂布器涂布均匀后将菌液涂布到平板上。用封口膜封住平板，37℃倒置过夜培养［3-4］。

2.2.2 重组菌株蛋白水平的验证 取30 mL 含有氨苄抗生素的LB 液体培养基于50 mL 锥形瓶中，加入1mL 菌液后分别37℃的恒温振荡培养箱中培养，2 h 后加入IPTG 至终浓度为1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超声破碎仪将收集的菌体破菌，并用镍柱纯化蛋白后进行SDSPAGE 电泳检测。取阳性实验结果作为实验菌株进行后续实验。

2.2.3 不同培养温度对大肠杆菌表达蛋白的影响 取30 mL 含有氨苄抗生素的LB 液体培养基于50 mL 锥形瓶中，加入1 mL 菌液后分别置于22℃和37℃的恒温振荡培养箱中培养，2 h 后加入IPTG 至终浓度为1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超声破碎仪将收集的菌体破菌，并用镍柱纯化蛋白后进行SDS-PAGE 电泳检测［5］。

2.2.4 不同诱导剂浓度对大肠杆菌表达蛋白的影响 取30 mL 含有氨苄抗生素的LB 液体培养基于50 mL 锥形瓶中，加入1 mL 菌液后分别置于37℃的恒温振荡培养箱中培养，2 h 后分别加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，4 h后收集菌液，OD600nm比色，用超声破碎仪将收集的菌体破菌，并用镍柱纯化蛋白后进行SDS-PAGE 电泳检测［7］。

2.2.5 蛋白纯化 当E.coli细胞的浓度达到OD600为0.8 左右时，开始诱导，并且记录开始诱导时间，然后按时间点处理样品：每个时间点时，将细菌离心沉淀，用细胞裂解液（Lysis buffer）重悬沉淀至10 mL，然后超声破碎1 min，再次离心，将离心后上清上样到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL的柱洗涤液（20 mmol/L 咪唑+细胞裂解液）洗涤3次，最后0.5 mL 的柱洗脱液（250 mmol/L 咪唑+细胞裂解液）洗脱，获得纯化后的目的蛋白样品［8］。

3 实验结果

3.1 诱导时间的影响 当E.coli的细胞量达到OD600=0.8 左右时，开始诱导并记录诱导时间，然后按时间点取样品1 mL，如表1所示。离心沉淀后，用细胞裂解液50 μL 重悬，取2 μL 重悬起的样品并加入18 μL 上样缓冲液，于95℃水浴煮沸5 min，取其中10 μL 液体进行蛋白质电泳。结果如图1，随着诱导时间增加，大肠杆菌细胞的全蛋白表达水平随之提高，各类蛋白浓度均有所增加。这情况同样存在于纯化后PYL10 蛋白的表达水平，并且在培养16 h 后目的蛋白浓度达到最高，如图2所示。

表1 PYL10蛋白的诱导表达时间条件

3.2 诱导温度 设置不同的培养温度条件探索诱导温度对于蛋白表达的影响，如表2所示。当E.coli细胞的浓度达到约为OD600为0.8 左右时，开始诱导，并且记录开始诱导时间，达到5 h 时，取细胞培养菌液样品，将细菌离心沉淀，用细胞裂解液重悬沉淀至10 mL，然后超声破碎1 min，再次离心，将离心后上清上样到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗涤液（20 mmol/L 咪唑+细胞裂解液）洗涤3 次，最后0.5 mL 的柱洗脱液（250 mmol/L咪唑+细胞裂解液）洗脱，获得纯化后的目的蛋白样品。结果如图3所示，随着诱导温度条件的提高，PYL10 蛋白表达水平随之提高，在22℃达到最大，当温度达到37℃时，PYL10 蛋白表达水平相对降低。

表2 PYL10 蛋白的诱导表达温度条件

3.3 诱导剂IPTG 浓度

表3 PYL10 蛋白表达的诱导剂不同浓度

按照表3所示，设置不同的IPTG 诱导浓度条件探索，当E.coli 细胞的浓度达到OD600约为0.8左右时，开始诱导，并且记录开始诱导时间。当达到12 h，取细胞培养菌液样品，将细菌离心沉淀，用细胞裂解液重悬沉淀至10 mL，然后超声破碎1 min，再次离心，将离心后上清上样到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗涤液（20 mmol/L 咪唑+细胞裂解液）洗涤3 次，最后0.5 mL 的柱洗脱液（250 mmol/ L 咪唑+细胞裂解液）洗脱，获得纯化后的目的蛋白样品。结果如图4所示，当诱导剂IPTG 浓度增加到200 μmol/L 时，PYL10 蛋白表达量最高。

4 实验结论和讨论

实验结果表明，在22℃时加入200 μmol/L 的IPTG 诱导表达16 h 最适合PYL10 的蛋白表达，这一结果与已发表论文中提到的结果是一致的［9］。本文新意在于系统性地探索了每个变量（表达温度、表达时间和诱导剂浓度）对于PYL10 蛋白表达的影响,并且将每个优化后的结果结合在一起, 以期找到一个最优化的、使得PYL10 蛋白表达量最大的条件。

尽管在22℃和37℃时培养菌液的吸光度值相近，即细胞密度无明显差异，但22℃时大肠杆菌蛋白表达明显高于37℃，可能是与在37℃时蛋白表达太快、折叠不好有关［10］。另外，IPTG 作为一种广泛应用的诱导剂，可竞争性地与阻遏蛋白结合从而启动目的蛋白的转录。如果浓度过低则达不到与阻遏蛋白结合的饱和浓度从而对目的蛋白的表达造成影响，如果浓度过高则造成经济上的不划算，因此0.2 mmol/L 的IPTG 浓度已经足够诱导重组蛋白的表达。