伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

兰德松，魏 澍，顾贵波*，侯振中

(1.东北农业大学 动物医学院/农业部动物疫病病原生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨150030；2.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳110164；3.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳110164)

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)为疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒属成员之一，该病毒具有广泛的宿主范围，能够感染大多数哺乳动物及一些禽类使其发生伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，该病以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要特征[1]。猪是PRV的自然贮存宿主，仔猪感染后导致中枢神经系统紊乱，死亡率可达100 %；成年猪感染后通常表现为呼吸道症状和增重减缓，急性感染耐过的猪则终身隐性带毒；怀孕母猪感染后常发生繁殖障碍。PR呈全球性分布，尤其在南美、亚洲和欧洲等生猪养殖密集地区广泛存在，给全球养殖业带来严重的经济损失[1]。

微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来基于实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)发展起来的对核酸进行检测、定量的新一代PCR技术，具有极高的灵敏度和特异性[2]。ddPCR的原理是将PCR反应体系进行微滴化处理形成数万至几十万个油包水微滴，将核酸分子有限稀释而分散到每个微滴中，PCR扩增反应后，对荧光信号进行检测，根据泊松分布原理与阳性微滴数即可计算出核酸初始拷贝数[3-4]。ddPCR与qPCR相比主要有以下三方面的优势：ddPCR是基于终点PCR，引物/探针退火效率的影响被最小化；不需要标准品，也不用制作标准曲线，直接计算核酸拷贝数，具有更高的灵敏度和准确度，实现了真正意义上的绝对定量；ddPCR是一种高通量的检测方法，每个反应孔进行15 000～20 000个PCR反应[2]。

ddPCR已初步应用于基因突变检测[5]、拷贝数变异检测[6]、转基因食品检测[7]、核酸的绝对定量[8-9]、病原微生物检测[3-4,10]和下一代测序[11]等领域。国内近年来相继建立了甲型流感病毒[8]、H3N2亚型猪流感病毒(SIV)[10]、猪PRV[3]和猪圆环病毒1型(PCV1)[4]的ddPCR定量检测方法。本研究以PRV复制必需基因gD基因和PRV疫苗株缺失的gE基因为靶基因，设计了2套用于鉴别检测的引物和探针，建立了能够区分PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株并精确定量的ddPCR鉴别检测方法，可为PR的早期防控和净化提供新的技术保障。

1 材料与方法

1.1 病料采集、病毒与质粒标准品 病料采自2016年～2017年辽宁省疑似PR发病猪场的猪脑、肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织样品。PRV野毒株、PCV2、猪瘟病毒(CSFV)、H1N1亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸由本实验室保存；pGEM-T-gD、pGEM-T-gE重组质粒标准品由本实验室构建[12]并保存；PR疫苗株Bartha-K61为西班牙海博莱(HIPRA)公司产品。

1.2 主要试剂 核酸提取试剂(适用于提取病毒DNA/RNA)购自天隆科技有限公司；2×TaqMan Fast qPCR Master Mix(货号：B639275-0005)购自宝生物工程(大连)有限公司；ddPCRTMSupermix for probes(货号：186-3023)、Droplet Generation oil for probes(货号：186-3005)购自Bio-Rad公司。

1.3 引物设计及合成 根据GenBank中登录的近年来国内分离的PRV强毒株及Bartha-K61疫苗株基因序列，针对gD基因和gE基因保守区，设计了扩增全长gD基因、gE基因的引物对，及用于qPCR和ddPCR的2套特异性引物及TaqMan探针，引物及探针序列参见文献[12]。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 病毒DNA的提取 按照核酸提取试剂说明书提取PRV野毒株和Bartha-K61疫苗株的病毒DNA，将病毒DNA进行10倍梯度稀释，置于-20℃保存备用。

1.5 PRV gD、gE基因ddPCR方法的建立及其条件优化ddPCR反应分为4个步骤：第1步为反应体系配制及优化，ddPCR反应体系(20μL)：2×ddPCR supermix for probes 10μL；上、下引物浓度设置为0.5μmol/L～0.9μmol/L，探针浓度为0.1 μmol/L～0.3μmol/L；模板DNA 2μL；用ddH2O补足至20μL。第2步为微滴生成，将20μL反应体系转移至微滴生成卡的“Sample”孔位中，将70μL Droplet generator oil加至微滴生成卡上对应的“Oil”孔位中，在微滴生成器中进行微滴生成。第3步为PCR扩增及反应条件优化，将生成的微滴转移至96孔专用反应板中，并封膜，在普通PCR仪上进行扩增：94℃3 min；94℃15 s、55℃～65℃1 min，40个循环；98℃10 min；4℃保存。升降温速率为2.5℃/s。第4步为微滴读取和分析，扩增结束后在微滴阅读器上进行ddPCR的微滴生成数读取和数据分析，通过比较微滴生成数、微滴分布状态及荧光信号强度来确定优化结果。

1.6 特异性试验 采用本实验室保存的PRV野毒株、Bartha-K61疫苗株、PCV2、CSFV、H1N1亚型SIV、PRRSV核酸，并进行适当稀释后(浓度控制在1拷贝/μL～1×104拷贝/μL)，用建立的PRV gD基因、gE基因ddPCR方法进行检测，验证两种ddPCR方法的特异性。

1.7 敏感性试验 用测定浓度并经10倍梯度稀释至1×100拷贝/μL～1×104拷贝/μL的pGEM-T-gD、pGEM-T-gE重组质粒标准品为模板进行ddPCR检测，同 时 用1×100拷 贝/μL～1×106拷 贝/μL的pGEM-T-gD、pGEM-T-gE重组质粒标准品为模板进行qPCR检测[12]，比较两种方法的灵敏性。需要注意的是，在ddPCR反应中需要将模板拷贝数稀释至合适浓度范围(1×100拷贝/μL～1×104拷贝/μL)内，扩增的阳性微滴数随着模板拷贝数的稀释倍数成反比，呈现良好的线性相关性。

1.8 重复性试验 取稀释至浓度为102拷贝/μL的pGEM-T-gD、pGEM-T-gE重组质粒标准品作为模板，进行两种ddPCR方法的批内和批间重复性试验。批内重复试验每份模板设3个重复，批间重复性试验选取3个不同时间段进行检测，对检测结果进行统计学分析。

1.9 临床样品检测 对2016年～2017年采自我省部分临床疑似PR发病猪场的猪脑、肺、肝脏、肾脏、淋巴结等样品45份，各取适量进行研磨处理。组织研磨液接种BHK-21单层细胞进行病毒分离。按核酸提取试剂盒说明取适量组织研磨液上清提取病毒核酸，分别用qPCR方法[12]和ddPCR方法进行PRV检测。

2 结果

2.1 ddPCR检测条件的确定 经过优化试验，确定：ddPCR引物终浓度为0.9μmol/L，探针终浓度为0.25μmol/L；扩增反应条件为：94℃3 min；94℃15 s、60℃1 min，40个循环；98℃10 min；4℃保存。升降温速率为2.5℃/s。建立的PRV gD基因、gE基因ddPCR反应体系和条件对扩增结果均良好，PRV gD基因、gE基因ddPCR的微滴散点图中阴、阳性微滴分界均明显，且中间弥散的微滴数占比很低(图1A、1C)。微滴频率分布图显示阴、阳性微滴分界明显，且中间无杂峰(图1B、1D)。结果表明，建立的PRV gD基因、gE基因ddPCR方法适用于对PRV进行定量检测分析。ddPCR方法的结果判定标准为：检测结果为阳性的直接显示数值，阴性样品显示“No Call”。

2.2 特异性试验结果 针对PRV gD基因的ddPCR方法对PRV野毒株和Bartha-K61疫苗株均能特异性扩增，而与PCV2、CSFV、H1N1亚型SIV、PRRSV无交叉反应(图2A)；针对PRV gE基因的ddPCR方法对PRV野毒株能够特异性扩增，而与PRV Bartha-K61疫苗株、PCV2、CSFV、H1N1亚型SIV、PRRSV无交叉反应(图2B)。结果表明，本实验建立的两种ddPCR方法特异性良好。

2.3 敏感性试验结果 针对PRV gD、gE基因的ddPCR方法检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL(图3A、3B)，而相应的针对PRV gD、gE基因的qPCR方法的检测限分别为39.4拷贝/μL、12.1拷贝/μL[12]，由此表明，建立的ddPCR方法分别比相应的的qPCR方法灵敏度高10倍和5倍。结果表明，建立的两种ddPCR方法均具有极高的灵敏度。

图1 PRV gD/gE ddPCR扩增的微滴散点图(A/C)与微滴频率分布图(B/D)Fig.1 Establishment of the scatter diagram(A/C)and frequency distribution histogram(B/D)of PRV gD/gE by the ddPCR

图2 PRV gD ddPCR(A)和PRV gE ddPCR(B)特异性试验结果Fig.2 The specificity test of the PRV gD(A)/gE(B)ddPCR

2.4 重复性试验结果PRV gD基因ddPCR反应批内和批间重复试验的变异系数(CV)值分别为2.06%、3.20 %；PRV gE基因ddPCR反应批内和批间重复试验的变异系数(CV)值分别为3.03 %、3.88 %(表1)。结果表明，建立的ddPCR方法重复性好、准确度高，检测结果稳定、可靠。

图3 PRV gD ddPCR(A)和PRV gE ddPCR(B)敏感性试验结果Fig.3 Scatter diagram for PRV gD/gE gene amplification with different concentrations of the templates by the ddPCR

表1 PRV gD基因和gE基因ddPCR的批内和批间重复性试验结果Table 1 Intra-batch and inter-batch reproducibility tests of ddPCR for PRV gD and gE gene

2.5 临床样品检测结果 利用病毒分离方法与本试验建立的针对PRV gD基因、gE基因的ddPCR、qPCR方法分别对45份临床样品进行PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的检测。结果显示，与病毒分离方法比较，ddPCR的敏感性为91.7 %，特异性为97.1 %，符合率为97.8 %；与ddPCR方法相比，qPCR的敏感性为83.3 %，两种方法的符合率为95.6 %。qPCR检出的2份可疑样品(Ct值30～37)，经ddPCR检测结果为PRV野毒株阳性，核酸浓度分别为8.6拷贝/μL和11.2拷贝/μL(表2)。表明本试验建立的ddPCR与qPCR的检测结果基本一致，ddPCR敏感性更高，对低拷贝的样品，检测结果更为准确可靠。

表2 45份临床样品检测结果Table 2 Comparison detection of 45 clinical samples

3 讨论

20世纪70年代初，中国从匈牙利引进Bartha-K61疫苗并逐渐在全国猪群中使用，从20世纪90年代至2011年底，中国80 %以上的猪只免疫了Bartha-K61株疫苗，PR得到了很好的控制，但自2011年底以来，我国多个省份即使免疫过Bartha-K61疫苗的猪场暴发PR，给我国养猪业带来了严重的损失[1,13]。因此，建立对当前流行的PRV野毒株的早期、快速、准确的鉴别检测方法对PR的防控具有重要意义。目前，在用的鉴别诊断方法主要有gB/gE-ELISA检测方法、基于gE的普通PCR[14]或qPCR方法[12,15]，但这些方法在PR的诊断中均存在一些缺陷，如ELISA方法对感染早期、隐性感染及感染后期等未产生抗体或抗体含量较低时易产生假阴性结果[12,15]；普通PCR敏感性较差，且需要电泳，较费时费力并增加了污染检测环境的风险，如朱小甫[14]等建立的针对gD和gE基因的套式PCR方法灵敏度约为1×102拷贝/μL；qPCR敏感性高，如兰德松[12]、Ma[15]等建立的针对PRV gE基因的qPCR方法灵敏度在已有报道中最高，均达到101拷贝/μL的水平，但需要制备内参标准品建立标准曲线来计算样本的含量，误差较大，只能实现相对定量检测，且因方法本身的相对变化以及内参的使用，不同实验室间即使检测相同样品结果也很难一致[8]。而本实验在充分比对当前流行的PRV变异株、传统野毒株与疫苗株序列基础上，利用数字PCR技术，针对PRV gD和gE基因设计了ddPCR检测方法。同时，用于ddPCR反应的DNA模板拷贝数不能高于微滴生成数，因为当阳性微滴数与微滴生成数接近时，不满足泊松分布，无法实现ddPCR的准确定量[7]，本实验将PRV gD基因、gE基因质粒标准品作为模板进行10倍梯度稀释，取拷贝数为103数量级的质粒标准品为模板，进行ddPCR试验，最终建立的PRV gD基因、gE基因ddPCR反应微滴生成数均超过13 000，表明微滴反应正常，可以对其进行后续的定量分析。试验结果表明，建立的方法针对性和可靠性更强，敏感性也更高，针对疫苗株和野毒株的通用检测的PRV gD基因和特异性检测野毒的PRV gE基因的ddPCR检测灵敏度分别达到3.9拷贝/μL和2.3拷贝/μL，特异性试验、重复性试验结果表明，该方法与其它相关病毒无交叉反应且重复性好；与陈亚娜[3]等建立的针对PRV gB基因的ddPCR方法相比(敏感性为6.1拷贝/μL)，本研究建立的方法敏感性更高，并且实现了对PRV野毒株与疫苗株的鉴别诊断。

本研究针对当前流行的PRV野毒株和广泛使用的gE基因缺失疫苗株，建立了ddPCR方法，并且可以作为临床上PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株鉴别和准确定量检测的有效技术手段。