两株不同血清型鱼源无乳链球菌生物学特性的比较研究

李亚军，耿 毅*，余泽辉，雷雪平，王世震，王春会，欧阳萍，黄小丽，陈德芳

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 温江611130；2.四川农业大学 水产系，四川 温江611130)

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)也称B族链球菌(Group BStreptococcus，GBS)，引起人类新生儿的脑膜炎和妊娠妇女的败血症等症状[1]，也可以引起奶牛乳房炎[2]和兔的败血症[3]，还可以感染尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、银鲳(Pampus argenteus)、宝石斑石鲈(Scortum barcoo)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)等多种鱼类[4-5]，给水产养殖业造成重大的经济损失。

根据荚膜多糖的类型，无乳链球菌分为10种不同的血清型(Ia、Ib、II-IX型)[6]，其中Ia型和III型是无乳链球菌感染人、牛和鱼的主要血清型[7]。目前对于不同血清型无乳链球菌间生物学特性差异分析的报道还很缺乏。本实验对两株血清型分别为Ia型和III型的齐口裂腹鱼源无乳链球菌在生长特性、生理生化特性、环境因子对其生长的影响、耐药性及致病性等多方面进行差异性比较，为探究该病原菌不同血清型的致病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 血清型分别为Ia型S07株与III型S03株S.agalactiae均由本室分离鉴定并保存。鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)由珠江水产研究所惠赠。MH琼脂培养基和脑心浸液培养基(BHI)购自北京欣经科生物技术有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；DNA Marker和蛋白酶K购自大连TaKaRa公司。健康齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)购自四川乐山某养殖场。健康斑马鱼(Danio rerio)购自南京大学模式动物研究所，为Tubingen品系。

1.2 两株菌生理生化特性的测定 利用VITEK 2 COMPACT 30全自动细菌分析系统对S03株和S07株进行生理生化特性的检测；同时采用微量生化反应管法测定两株菌的蔗糖、葡萄糖和马尿酸等17种生化反应做为补充，各生化管在接种菌后28℃培养24 h～56 h，判定其结果。

1.3 两株菌体外生长曲线的测定 用BHI液体培养基将两种细菌的菌液OD600nm值调整一致后分别接种于BHI液体培养基中28℃、180 r/min培养，每隔2 h取样，测定其OD600nm值，直至OD600nm值不再增长为止，绘制两株菌的体外生长曲线。

1.4 温度、pH值、盐浓度对两株菌生长的影响在BHI液体培养基中接入等量两株菌的菌液，分别在24℃、28℃、32℃和37℃，pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，氯化钠浓度为0、0.5%、1%、2%、4 %和8 %条件下180 r/min震荡培养，每隔4 h取样测定两种菌菌液OD600nm值，分别绘制温度、pH、盐浓度对两株菌生长影响的生长曲线。

1.5 两株菌药敏试验 药敏试验参照CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准[8]，采用Kriby-Bauer纸片扩散法对两株菌进行药物敏感性试验。

1.6 两株菌细胞粘附、侵入能力测定 参照WANG等[9]方法，采用EPC为细胞模型对两株菌进行EPC的粘附和侵入试验。

1.7 两株菌对齐口裂腹鱼和斑马鱼的致病性试验体质量11.5±1.2 g的健康齐口裂腹鱼和体质量0.4±0.05 g的健康斑马鱼暂养7 d后，每种鱼均分为14个组(每个菌株7个组，6个实验组、1个对照组)，每组20尾。实验组分别腹腔接种浓度为1×109cfu/mL、1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL、1×105cfu/mL和1×104cfu/mL S03株和S07株菌液(齐口裂腹鱼注射0.1 mL，斑马鱼注射0.05 mL)，对照组鱼腹腔注射等量的无菌生理盐水。水温24±1.0℃，记录感染21 d内鱼死亡情况，采用Bliss法和Bliss软件分别计算两株菌对两种鱼的LD50。

2 结果

2.1 两株菌的生理生化特性的测定VITEK 2 COMPACT 30全自动细菌分析系统检测和补充生化试验结果见表1，结果表明S03株和S07株在生理生化特性上表现出明显差异，S07株相对于S03株缺乏利用多种糖类、代谢酶的能力。

表1 S03和S07株S.agalactiae的生化试验结果Table 1 The biochemical test of S.agalactiae S03 and S07 strains

2.2 两株菌体外生长曲线的测定 血清III型S03株和Ia型S07株的生长曲线显示，S03株的对数期在6 h～18 h，20 h以后进入稳定期；S07株的对数期在20 h～42 h，46 h以后进入稳定期(图1)。表明，S03株的生长明显快于S07株，而且S03株的OD600nm最大值约是S07株的2倍。

图1 S03株和S07株的生长曲线Fig.1 The growth curve of S.agalactiae S03 and S07 strains

2.3 温度、pH和盐浓度对两株菌生长的影响 温度对S03株和S07株影响的生长曲线显示，以28℃时的生长曲线为参考，S03株和S07株在32℃和24℃时其生长受温度影响的趋势相对一致，而S03株在37℃时生长速度较快，S07株在37℃时不生长(图2)。表明S03株对温度的耐受能力强于S07株。

pH对S03株和S07株影响的生长曲线显示，以在pH7.0时的生长曲线为参考，S03株和S07株在pH6.0、pH8.0和pH9.0时变化基本一致，而在pH5.0时，S03株的生长受其影响程度要小于S07株(图3)。表明S03株对pH的耐受能力强于S07株。

盐度对S03株和S07株影响的生长曲线显示，以盐度为0时生长曲线为参考，在盐度分别为0.5%、1 %、和8 %时S03株和S07株生长曲线变化趋势基本一致，但在盐度为2 %时，S03株生长受其影响较小，S07株生长则明显受到抑制，而且在盐度为4 %时，S03株能够生长但S07株不能生长(图4)。表明S03株对盐浓度耐受能力强于S07株。

图2 温度对S03株和S07株生长影响的生长曲线Fig.2 The effect of temperature on the growth of S.agalactiae S03 and S07 strains

图3 pH对S03株和S07株生长影响的生长曲线Fig.3 The effect of pH on the growth of S.agalactiae S03 and S07 strains

图4 盐度对S03株和S07株生长影响的生长曲线Fig.4 The effect of salinity on the growth of S.agalactiae S03 and S07 strains

2.4 两株菌的药敏试验结果 药敏试验结果显示血清III型S03株对氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、四环素、强力霉素、红霉素和克林霉素均耐药，而Ia型S07株对所测的抗生素均敏感或中度敏感(表2)。表明S03株的耐药性显著强于S07株。

表2 S03株和S07株药物敏感性试验结果Table 2 The antibiotic resistance of S.agalactiae S03 and S07 strains

2.5 两株菌对细胞黏附、侵入能力试验 两株菌对EPC黏附、侵入能力试验结果显示，S03株和S07株的侵入EPC的活菌数接近1∶1，但S07株黏附活菌数是S03株的近2倍(表3)。表明S03株和S07株侵入能力相近，但S07株的黏附能力强于S03株。

表3 S03株和S07株黏附和侵入能力试验结果Table 3 The adhesive capacity and invasion of S.agalactiae S03 and S07 strains

2.6 两株菌对齐口裂腹鱼和斑马鱼致病性试验 将不同浓度的两株菌分别经腹腔接种齐口裂腹鱼和斑马鱼，记录感染21 d内鱼死亡情况，并计算该两株菌对这两种宿主的LD50。结果显示，斑马鱼和齐口裂腹鱼分别在感染第2 d和第3 d开始死亡，濒死斑马鱼鳍条和下颌均严重出血，剖检可见其内脏器官均有明显出血现象。濒死齐口裂腹鱼鳍条基部轻度出血，体色发黑，颅顶部颜色变淡或出血；剖检可见其肝和肾不同程度出血或淤血。对照组齐口裂腹鱼和斑马鱼均未出现异常。各组鱼死亡情况见表4，Bliss软件计算S07株对齐口裂腹鱼的LD50为8.9×103cfu/mL，对斑马鱼的LD50为1.88×103cfu/mL；S03株对齐口裂腹鱼的LD50为5.27×108cfu/mL，对斑马鱼的的LD50为7.09×107cfu/mL。表明Ia型S07株的毒力显著强于III型S03株。

3 讨论

自Robinson和Meyer[10]1966年首次报道无乳链球菌可以感染金色美鳊鱼(Notemigonus crysoleucas)以来，鱼类感染该菌的报道在全世界范围内呈上升趋势，无乳链球菌已成为严重危害鱼类的主要致病菌。现有资料表明，感染鱼类的无乳链球菌血清型主要为Ia、Ib和III型3种，而在我国这3种血清型均有分布[11]，目前还未见不同血清型无乳链球菌在生物学特性上的差异报道。本研究对III型S03株和Ia型S07株无乳链球菌多种生物学特性差异分析结果表明，两株菌在生长特性、生理生化特性、耐药性、粘附能力和致病性等方面均存在较大差异，其中Ia型的致病力明显强于III型，因此在该病的预防中对Ia型应高度重视。病原菌毒力是其黏附、定植、侵入、增殖、扩散及抵抗宿主防御的能力和其毒素能力的综合，而病原菌对宿主细胞或粘膜表面的黏附是其感染机体的首要步骤[12]，本研究中Ia型S07株的黏附能力强于III型S03株，这应当是Ia型毒力强的原因之一，但是否是其强毒力的主要原因还需进一步研究。

表4 S03株和S07株对齐口裂腹鱼和斑马鱼的致病性试验结果Table 4 The pathogenicity test of S.agalactiae S03 and S07 strains to Schizothorax prenanti and Danio rerio

细菌的生长速度是其增殖和传播的重要因素。本实验通过两株菌生长曲线的对比结果显示S03株的生长速度明显快于S07株，表明III型无乳链球菌比Ia型生长更快。Rosinski-Chupin等研究显示鳟源S.agalactiaeST261型2-22菌株的基因组为1.8 mb比常见的ST7型菌株基因组小10 %～25 %，并认为这是一种退化行为—碳源利用能力降低并开始过渡到专性病原体的生活方式[13]。本研究中S07株相对于S03株对葡萄糖、麦芽糖、PHOS、APPA和AGLU等多种物质均不能反应而且对温度、pH、盐度等环境因子的耐受性更差以及致病性更强的特性也从表型上印证了这一观点，推测Ia型S07株的基因组可能比III型S03株小，其后的基因组测序也应证了该推测(基因组测序结果将另文报道)。

Rodkhum等研究显示高水温条件下鱼类对无乳链球菌的易感性更强，表明温度是影响无乳链球菌致病力的重要因子[14]。刘志刚等报道无乳链球菌培养温度为25℃～40℃时，随着培养温度的升高，该菌的生长速度加快，并且认为37℃是其最适生长温度[15]。但本研究的结果却与之不同，III型S03株在28℃和37℃时生长均比较快，而Ia型S07株在28℃时生长最快，在37℃时则不生长。细菌的最适生长温度是由温度对生物体内众多酶反应的综合作用决定的，在一定限度内温度升高其生长代谢会加快，但超过限度会使细菌的部分酶失活，菌体生长进入停滞状态[16]。因此，S03株可能在28℃和37℃时是不同的关键酶促反应的最适温度，而S07株可能在28℃时其总体酶活性最高，也表明III型和Ia型无乳链球菌在温度的敏感性存在差异，III型对温度耐受能力更强。pH对生长影响的试验结果显示，S07株受pH影响相对S03株更大，表明III型无乳链球菌对pH的耐受能力强于Ia型；在pH8.0时，S03株在pH6.0和pH7.0时比S07株的生长更慢，表明弱碱环境对这两株菌生长不利，因此，在养殖过程中使用生石灰等维持水体弱碱性环境对降低无乳链球菌的感染可能有帮助。另外，本研究中III型S03株呈现7重耐药，而Ia型S07株对所测的抗生素均敏感或中度敏感，表明III型无乳链球菌比Ia型耐药性强，III型虽然致病力弱于Ia型，但因其具有的高度耐药性，给药物治疗带来极大困难。研究表明，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的耐药接合质粒能够与毒力质粒发生同源重组，导致耐药基因和毒力基因的广泛传播出现强毒与高耐药菌株[17]。本研究显示Ia血清型无乳链球菌的毒力强，耐药性低，但III型毒力弱，耐药性强，它们是否会像鼠伤寒沙门氏菌那样在自然界发生耐药基因和毒力基因的交流与转移，出现强毒与高耐药菌株值得进一步研究与重视。