siRNA干扰技术在耐药性卵巢癌中的研究进展

李 霞,童晓文

1.同济大学医学院,上海 200092; 2.同济大学附属同济医院妇产科,上海 200065

卵巢癌是危及女性健康的最常见恶性肿瘤之一,其死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首。美国癌症统计报告显示,2017年有22 440例卵巢癌新发病例,14 080例患者死于卵巢癌,2006—2012年卵巢癌5年生存率仅为46%,其死亡率占女性癌症相关死亡率的5%,是女性癌症相关死亡的第5大原因[1]。卵巢癌起病隐匿,早期临床症状不典型,缺乏有效的筛查和诊断方法,超过75%的患者就诊时已是临床晚期[2],目前卵巢癌的一线治疗方案仍是积极的肿瘤细胞减灭术及术后辅以铂类和紫杉醇为基础的联合化疗,70%～80%患者在一线方案治疗后能得到临床缓解[3-4]。然而,化疗耐药是卵巢癌复发和治疗失败的最主要原因之一,大约20%～30%的患者在化疗时就表现出化疗耐药病情进一步进展,大约25%的患者在化疗结束后6个月内会出现病情复发[5]。鉴于卵巢癌的高复发率和高死亡率,克服卵巢癌化疗耐药性的研究一直是科研人员关注的热点问题。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可通过RNA干扰作用特异性沉默耐药相关基因的表达来改善化疗药物的抗癌效果。

1 siRNA作用机制

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象,是生物界的一种古老且进化上高度保守的基因表达调节机制。1998年Fire等[6]发现将dsRNA注入线虫(C.elegans)可特异性抑制与dsRNA同源的基因表达,且dsRNA抑制效果是单链RNA的10～100倍。他们将这种dsRNA抑制特定基因表达的现象称为RNA干扰。siRNA在RNA干扰过程中发挥核心作用,是RNA干扰途径中的中间产物,是RNA干扰发挥效应的必需因子。

小干扰RNA是由dsDNA经Dicer酶(RNase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成的一种双链小RNA分子(21～25个核苷酸)。细胞内可被Dicer酶识别的dsRNA可由多种途径产生,包括转基因、病毒、转位子和细胞内基因等[7]。dsRNA被Dicer酶识别并降解成具有特定长度和结构的小片段RNA,即siRNA。siRNA在细胞内与一些蛋白(包括AGO蛋白、TRBP蛋白、Dicer酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。随后,siRNA的随从链被AGO蛋白切割、释放出来,引导链被保留在成熟有功能的RISC中。siRNA的引导链与靶mRNA序列互补配对,启动序列特异性切割通路,由RISC中的AGO蛋白切割并降解靶mRNA[8]。siRNA不仅能引导RISC切割同源mRNA,还可作为siRNA扩增的模板,在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解[9]。

2 siRNA递送至卵巢癌

siRNA可以通过RNAi效应特异性地沉默靶向基因,它控制靶向基因表达的能力为基因疗法治疗癌症带来了新的希望。但siRNA 具有较差的药理特性,如易被血清中的核酸酶降解、有难以渗透血管内皮及细胞膜、不易从核内体中释放、先天免疫效应、分子量小易被肾组织排泄等,这对siRNA的临床应用提出了巨大挑战[10-11]。因此,开发一种安全、稳定、高效的siRNA递送系统并将其递送至细胞或生物体内,进而发挥沉默靶向基因的生物效应是至关重要的。目前,将外源性基因导入细胞的方法主要包括两大类,即病毒载体的递送和非病毒载体的递送。

2.1 病毒载体的递送

以病毒为载体,通过病毒感染的方式将外源基因导入到细胞中是基因递送的常用方式,其中以腺相关病毒、慢病毒和腺病毒转染系统最为常用。病毒是最早用于体内递送的siRNA的载体,shRNA是具有发夹结构的siRNA前体,将人工设计合成的shRNA的模板DNA分子通过质粒或者病毒转入细胞,在细胞内转录出shRNA。shRNA经Dicer酶剪切成siRNA,进而诱发RNAi效应抑制靶基因表达。目前已有成熟的商品化的shRNA质粒表达载体,如ThermoFisher公司的pSilencer siRNA 表达载体系列。Yan等[12]的研究中用慢病毒介导的shRNA成功敲除UHRF1基因促进了HO-8910和HO-8910细胞凋亡、抑制细胞增殖、降低了肿瘤细胞侵袭能力。Zhu等[13]的研究中同样利用慢病毒介导shRNA沉默WFDC2 (HE4)基因,以探讨其在人卵巢癌细胞系SKOV3细胞增殖、凋亡、运动和侵袭等生物学行为改变的作用及可能机制。

2.2 非病毒载体的递送

非病毒载体的递送常用方法包括磷酸钙共沉淀、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染等。近年来将siRNA递送至卵巢癌研究中的常用非病毒载体系统主要集中在脂质体、阳离子聚合物、纳米无机材料等。

脂质体 (liposome) 系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体,按其所带电荷可分为阳离子、阴离子和中性离子脂质体三类。其中阳离子脂质体对转染的细胞类型、siRNA类型和分子量有很高的包容性,是脂质体中乃至所有siRNA载体中最常见的载体,且脂质体可以被进一步表面修饰,在Chen等[14]的研究中构建了氧化还原敏感性寡肽脂质体以共同递送紫杉醇(PTX)和抗survivin siRNA(PTX/siRNA/SS-L)。

阳离子聚合物类载体种类多样,包括聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine,PEI)、环糊精(cyclodextrins,CD)、壳聚糖(chitosan,CH)等,不同的阳离子聚合物转染效率和安全性因聚合物的结构而有所不同[15-17]。阳离子聚合物还具有生物相容性良好、可生物降解、易修饰等特点,在Teo等[18]的研究中利用叶酸(FA)和PEG修饰的PEI成功地将PD-L1 siRNA传递到EOC细胞中,PEG和FA不仅降低了细胞毒性,还通过受体介导的内吞作用增强肿瘤细胞对siRNA的靶向吸收。

金、介孔二氧化硅等纳米无机材料应用于siRNA 的传递在近些年受到广泛关注[19-20],这得益于纳米材料具有负载率高、生物相容性和生物降解性良好等优点。除此之外,纳米颗粒作为基因载体还可在其表面耦合各种各样的物质,如治疗药物、靶向配体、荧光染料等,在Chen等[21]的研究中开发了一种由Au-Fe3O4纳米粒子递送系统,实现siRNA和适配体的共同靶向递送。

3 siRNA 在耐药性卵巢癌中的研究

研究发现多药耐药性(multiple drug resistance,MDR)是卵巢癌有效化疗的主要障碍之一。多药耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时,对化学结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药。多药耐药形成机制非常复杂,涉及细胞内化疗药物积聚浓度的下降,细胞解毒功能增强,细胞凋亡的减少等,与多药耐药相关的基因或蛋白包括多药耐药基因MDR1及其表达的P-糖蛋白(P-gp)、 多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-related protein,MRP)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)、DNA拓扑异构酶Ⅱ、细胞凋亡相关基因等[22-25]。 siRNA通过RNAi效应下调或者抑制MDR相关基因的表达以改善卵巢癌化疗耐药,提高化疗药物的化疗效果,针对这一设想,科研人员对此进行了大量的实验研究。

3.1 体外研究

MDR1编码的膜型糖蛋白P-gp属于ABC转运蛋白超家族,其底物是具有细胞毒性的代谢物或化合物,P-gp能依赖ATP提供能量将底物泵出细胞外。在生理状态下P-gp 表达较为广泛 ,但水平较低。而在肿瘤细胞中 P-gp的过表达则可能是其在MDR型药物诱导下产生,P-gp作为“药物排除泵”将化疗药物泵出细胞,导致细胞内化疗药物积聚浓度降低而产生耐药。P-gp低表达可能成为临床化疗中一个有用的预测指标[26-27]。Deng等[28]的研究中就是通过逐渐增加浓度的顺铂(DDP)处理而建立的顺铂耐药卵巢癌细胞系SKOV-3/DDP,并构建包含MDR1基因短发夹RNA(shRNA)的MDR1 siRNA表达质粒,转化入减毒沙门菌SL7207 株,将SKOV-3/DDP细胞与重组沙门菌一起温育,结果显示与亲代细胞系相比,耐DDP的SKOV-3/DDP细胞表达更高水平的MDR1,感染沙门菌株MDR1 siRNA质粒的SKOV-3/DDP细胞中MDR1的表达下调,逆转细胞的DDP耐受性。Guo等[29]依据静电相互作用设计了LAH4-L1-siRNA纳米复合物(LSCs)递送系统,LSCs可以在SKOV-3细胞上实现87.3%的MDR1基因沉默和85%的P-gp下调,更重要的是,结合化疗药物,SKOV-3细胞生长抑制率可达82.9%。

在Yang等[30]的研究中,引入聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]纳米粒子系统作为“双重RNAi递送系统”,以包含MDR1和Bcl-2 siRNA。Bcl-2基因是Bcl-2家族的重要成员之一,参与调控细胞程序性死亡,其在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用,其表达蛋白可抑制多种组织细胞的凋亡。研究发现卵巢癌表现出Bcl-2基因的过度表达,表达高水平的Bcl-2的卵巢癌对化疗药物耐药[31-32]。“双重RNAi递送系统”用于同时抑制药物流出和细胞死亡防御途径。由于两种途径的相互依赖性,其显示出比单独抑制耐药卵巢癌细胞中的药物流出或抗凋亡更强的药物敏感性,以分别克服紫杉醇和顺铂对紫杉醇耐药SKOV3-TR和顺铂耐药A2780-CP20细胞的化疗耐药性。

He等[33]的报告首次使用纳米级金属有机框架(NMOFs)共同传递顺铂和三种siRNAs(P-gp、Bcl-2、survivin)至顺铂耐药SKOV3细胞株。Survivin是凋亡蛋白抑制剂( IAP) 家族成员之一,具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能。研究发现在多种肿瘤包括卵巢癌中均有过度表达,抑制survivin的表达可能会导致诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长并且促进肿瘤细胞对放化疗的敏感性,Survivin可能作为抗肿瘤治疗的一个合适靶点[34]。NMOFs保护siRNAs免受核酸酶降解,增强siRNAs的细胞摄取,促进顺铂耐药的卵巢癌细胞SKOV3中的siRNA从核内体逃逸以沉默MDR基因。在体外,根据细胞活力测定,DNA梯状条带等结果所示,NMOFs共同递送顺铂和三种siRNAs导致化疗效果的提高。

3.2 体内研究

在Yang等[35]的研究中,设计基于透明质酸(HA)的自组装纳米颗粒HA-PEI/HA-PEG,成功靶向递送MDR1 siRNA至过表达CD44受体的MDR卵巢癌细胞系OVCAR8TR,除进行细胞实验有效地下调OVCAR8TR细胞MDR1和P-gp的表达,还进一步在OVCAR8TR卵巢癌小鼠模型中施用HA-PEI/HA-PEG/MDR1siRNA纳米颗粒,随后使用紫杉醇处理,体内实验结果显示HA-PEI/HA-PEG/MDR1siRNA纳米颗粒和紫杉醇的联合施用对卵巢癌小鼠模型肿瘤生长有显着抑制作用,有效降低的P-gp表达、增加细胞凋亡。

Salzano等[36]开发了自组装聚合物胶束(PM),能够有效地共同负载survivin siRNA和化疗药物,如紫杉醇(PXL)。在PXL抗性的SKOV3-tr卵巢癌的动物模型中,研究survivin siRNA/PXL PM纳米制剂施用后survivin的表达情况,治疗功效和生物效应的变化。结果揭示了肿瘤组织中survivin mRNA和蛋白表达的显着下调,survivin siRNA/PXL PM具有有效抗癌活性,且肿瘤保持不受相同量的单独游离PXL影响。与单纯使用PXL相比,survivin siRNA/PXL PM使肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性明显增加,细胞凋亡率提高,抗癌活性得到改善。

4 结语

化疗药物的耐药性是卵巢癌治疗过程中的重大难题,克服化疗耐药、增加化疗药物敏感性成为卵巢癌治研究热点。siRNA可通过RNA干扰作用沉默耐药相关基因的表达以提高化疗药物的敏感性,改善化疗药物的抗癌效果。但是,目前的研究主要局限于实验室,在临床应用方面还面临着诸多问题,例如如何设计高效、特异的siRNA序列,开发安全、高效的siRNA递送系以及体内应用的安全性等。相信随着该领域研究的不断深入,siRNA干扰技术在将来可安全、有效地应用于临床疾病的治疗。