解脲脲原体耐药性研究进展

郭炽鹏，陆春，朱国兴

中山大学附属第三医院皮肤性病科，广州 510630

解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum，U.urealyticum)感染可引起泌尿生殖系统疾病，也可导致脑、肺等其他器官损伤。目前，用于治疗解脲脲原体感染的抗菌药物主要有喹诺酮类、大环内酯类和四环素类，有关解脲脲原体对上述药物的耐药性研究已有报道。解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药性增加的原因主要为gyrA、gyrB、parC和parE等基因的突变；对大环内酯类药物耐药性增加的原因主要为23S rRNA亚基或核糖体蛋白L4或L22基因的突变；对四环素类药物耐药性增加的原因主要为tet(M)的存在[1-11]。不同研究表明，以上这些耐药突变位点的分布存在差异，生物膜的产生可能加重耐药现象[12-13]。目前，关于解脲脲原体对喹诺酮类、大环内酯类和四环素类药物耐药性的研究主要集中在检测上述突变位点。研究过程主要包括以下几个步骤：①利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增目的基因；②对PCR产物进行测序；③与相应ATCC株进行序列比对并找出突变位点等[6,11,14]。本文通过PubMed检索近几年有关解脲脲原体耐药性的相关研究，对已发现的耐药位点分布和生物膜形成前后药敏变化进行归纳整理，以期加深对其耐药机制的了解并指导耐药菌快速检测，从而加强抗菌药物管理并减少耐药性产生。

1 喹诺酮类药物的耐药突变

对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究主要集中在对gyrA、gyrB、parC和parE等基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region，QRDR)相关突变位点的检测。许多研究表明，发生于parC基因的典型突变S83L是导致解脲脲原体对喹诺酮类药物耐药性增加的常见原因[15-16]，Kawai等[14]研究表明，该突变可能导致喹诺酮类药物对解脲脲原体的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加32倍。然而，并非所有研究均在耐药菌株中检测到上述4个基因突变[15,17]。在部分关于左氧氟沙星耐药分离株的研究中，未能在gyrA、gyrB或parE等基因中检出突变位点存在。

Piccinelli等[18]对筛选出的85株对环丙沙星和(或)氧氟沙星耐药的支原体进行分析，证实了一些已报道的突变位点，如parC中出现的S83L、E87Q和E87K，ParE中的R448K等。该研究结果显示，对于从gyrA扩增出的基因片段，最常见的突变是L176F，其他突变位点包括存在于微小脲原体(Ureaplasmaparvum，U.parvum)中的F67I、K78I、G179D、S174R，以及解脲脲原体(T960)中的D77V。在parC中检出4个突变：微小脲原体中的V141I(该突变导致对氧氟沙星产生中等程度耐药)，以及解脲脲原体(T960)中的I52N、L49F和E153D。通过对gyrB基因序列进行检测，发现微小脲原体分离株中存在E502Q、R523等突变，并在1株解脲脲原体(T960)分离株中发现三重突变。在5株微小脲原体菌株中检测到parE基因中的6个点突变：Q412K、Q412P、S413N、H491Q、E466K和M404L。上述突变导致相应表达蛋白发生7个氨基酸替换。

不同突变可存在于同一基因中，如有研究发现耐喹诺酮类药物的解脲脲原体血清型1中同时存在F67I和K78I两个点突变[18]。同一菌株中也可能存在两个基因的双重突变。对于微小脲原体不同血清型和解脲脲原体两种生物群混杂感染的分离株，Piccinelli等在其中3株分离株中发现了如下突变：gyrA中的L176F、双重突变(gyrA基因中的L176F和parE基因中的Q412T)。Kawai等[14]在一份DNA样品中同时检出存在于gyrB基因和parC基因中的点突变(分别为P462S和S83L)。

并非所有基因突变均能导致耐药性产生。例如，在一些多重突变菌株中检测到S83L，因此除S83L外可能存在中性突变。Valentine-King等[17]在对喹诺酮类药物敏感的解脲脲原体分离株中发现了存在于parE基因QRDR内的两个突变位点，其中一个导致R437I非同义替换，另一个导致G480S非同义替换，该分离株对左氧氟沙星和环丙沙星均较敏感(MIC分别为1 μg/mL和2 μg/mL)，与其他受试菌株的敏感性一致。因此，这种突变虽然位于parE的QRDR，但似乎不会降低喹诺酮类药物的有效性。

在对耐药位点的检测中还发现了一些尚未证明是否介导耐药的突变位点，如发生于gyrA基因的L176F，gyrB基因的E502Q，以及parE基因的Q412K、Q412P、Q412T等[18]。

为评价parC基因S83L和S83W突变对表达产物结构变化的影响，Kawai等[14]通过同源建模等技术对各肽的结构模型进行预测分析，发现喹诺酮C-3羧酸、C-4羰基和Mg2+对其与DNA拓扑异构酶的相互作用有重要影响，而S83L和S83W可通过位阻作用干扰菌株与喹诺酮类药物的适当结合。

2 四环素类药物的耐药突变

对四环素类药物的耐药机制研究主要集中在tet(M)检测。Valentine-King等[17]对四环素类耐药解脲脲原体分离株和4株敏感分离株中的tet(M)片段进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测，获得约400 bp的条带，相当于解脲脲原体ATCC 33175中的tet(M)位置，而敏感分离株中未检测到该基因。

然而，并非检测出tet(M)决定簇的菌株均对四环素类产生耐药。Fernández等[15]在250株分离株中筛选与四环素类耐药相关的tet(M)决定簇，发现10株(4.9%)微小脲原体分离株呈阳性(其中仅1株对四环素耐药，另外9株的四环素和多西环素MIC均较低)，而在解脲脲原体(T960)中未分离出该基因。Kotrotsiou等[19]利用A7琼脂平板，从100例成人泌尿生殖系统中分离出解脲脲原体，其中87份标本分离出微小脲原体，12份标本分离出解脲脲原体(T960)，两生物群均从单一样品中分离出来，且所有分离株均对四环素表型敏感。检测上述样本，发现35株携带tet(M)，其中29株(82.9%)为微小脲原体、5株(14.3%)为解脲脲原体(T960)、1株(2.9%)为微小脲原体/解脲脲原体(T960)混合株，3组间无统计学差异。10例有症状男性患者中有4例(40%)tet(M)携带者，34例有症状女性患者有11例(32.4%)tet(M)携带者，而56例无症状妇女中亦有20例(35.7%)tet(M)携带者，3组间无统计学差异。

生殖器支原体对四环素类产生耐药性主要是由于获得了tet(M)决定簇，该过程通常与Tn916/Tn1545家族的接合转座子元件相关。Mardassi等[20]对取自突尼斯境内部分不育症患者的20株微小脲原体和2株解脲脲原体(T960)分离株进行四环素耐药性评估，并通过PCR检测tet(M)和int-Tn(int-Tn基因编码Tn916/Tn1545样转座子的整合酶)。微小脲原体对四环素的耐药率为 22.72%，且所有耐药菌株均含tet(M)和int-Tn序列。对tet(M)扩增子的核苷酸序列进行分析，发现微小脲原体和解脲脲原体(T960)中所有耐四环素分离株均具有一种独特的序列。分子分型研究表明，单个tet(M)基因序列最有可能通过Tn916/Tn1545样转座子来传递，从而导致微小脲原体和人型支原体(Mycoplasmhominis)分离株中出现大部分四环素耐药突变株。tet(M)基因序列存在于不同支原体属中，且广泛存在于系统发育状态不同的菌株中。一个合理的解释是，它可能受益于有效的水平转移环境，从而具有高度的传播能力。

3 大环内酯类药物的耐药突变

对大环内酯类药物的耐药机制研究主要集中在对23S rRNA亚基或核糖体蛋白L4或L22基因的检测。Govender等[11]在对红霉素(2株)和红霉素+阿奇霉素(1株)产生耐药性的3株微小脲原体中观察到L22核糖体蛋白突变，其中菌株Up-8显示6个氨基酸改变，Up-38显示3个氨基酸改变，Up-71显示6个氨基酸改变。而在另一株红霉素+阿奇霉素抗性菌株中未检测到L22蛋白变化。4株菌株未发现以下序列突变：两个23S rRNA操纵子；大环内酯修饰基因erm(A)、erm(B)、erm(C)和erm(E)；外排泵基因msr(A)、msr(B)、msr(C)和msr(D)。

Dando等[21]通过实验研究，对12只怀孕母羊于妊娠55 d时进行羊膜内接种，接种物为含多种微小脲原体亚型的临床株。随后于妊娠100 d时用红霉素治疗(肌内注射，每日30 mg/kg，n=6)或注射生理盐水(肌内注射，n=6)，并于妊娠125 d后经外科手术取出胎羊。尽管所有母羊注射了相同接种物，但慢性羊膜内感染后，在羊水和绒毛膜羊膜内检测到的脲原体存在显著差异。从绒毛膜羊膜(而不是羊水)中分离出的脲原体23S rRNA基因的结构域Ⅴ中观察到许多多态性，导致镶嵌样序列形成。绒毛膜羊膜分离株还含有大环内酯类抗性基因erm(B)和msr(D)，且与罗红霉素MIC有关。值得注意的是，这种变化与脲原体是否接触红霉素无关，表明低剂量红霉素不会诱导子宫内脲原体对大环内酯类药物的耐药。

4 生物膜形成与耐药性

解脲脲原体具有形成生物膜的能力，有研究提示其生物膜形成后药物敏感性下降。García-Castillo等[12]对9株具有生物膜形成能力的解脲脲原体进行研究，发现生物膜形成前后菌株的耐药性发生如下变化：红霉素0%对44%(P=0.02)，泰利霉素22%对77%(P=0.02)，环丙沙星66%对100%，左氧氟沙星0%对33%，四环素0%对33%；所有菌株在生物膜形成前后均对克拉霉素敏感。Feng等[13]对69株解脲脲原体进行研究，发现42株为耐药株(同时耐环丙沙星和氧氟沙星)，27株为敏感株(对环丙沙星和氧氟沙星均敏感)，且耐药菌比敏感菌产生更多生物膜(P<0.05)。研究发现，生物膜形成后MIC增加，代谢相关基因ureC表达增加(P<0.05)，但喹诺酮类耐药相关基因gyrA的表达在生物膜形成前后无统计学差异。

也有研究显示，生物膜形成前后解脲脲原体的药物敏感性无统计学差异。Pandelidis等[22]检测来自早产新生儿的43株临床分离株和5株ATCC菌株在生物膜形成前后的药物敏感性，发现生物膜形成前后阿奇霉素和红霉素的药物敏感性无统计学差异。阿奇霉素对解脲脲原体(T960)临床分离株的MIC50和50%最小生物膜形成抑制浓度(50% minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC50)高于微小脲原体，但支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)婴儿与非BPD婴儿的MIC或MBIC无差异。

5 药物敏感性与多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)

上述研究主要集中于对已知突变位点的检测，而MLST为研究解脲脲原体耐药株的分布提供了新的思路。为更好地了解解脲脲原体的分子流行病学和群体结构，Zhang等[23]开发了基于解脲脲原体4个管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的MLST方案，应用于药物敏感性菌株研究，并检测超流行谱系和致病株。Fernández等[15]使用针对4个管家基因的引物，对46株分离株[30 株微小脲原体和16株解脲脲原体(T960)]进行MLST分析，包括左氧氟沙星耐药分离株、所有携带tet(M)分离株，以及代表不同研究时期和样品来源的一组敏感分离株，利用eBURST软件建立克隆性并确定分离物之间的潜在关系。MLST结果显示，30株微小脲原体存在14个克隆群，属于同一克隆复合体(clonal complex，CC)且具有3个共有基因座的ST1和ST56是最常见的克隆群，分别有6株和5株。16株解脲脲原体(T960)中存在7个谱，其中ST47(5株)和ST9(3株)属于同一CC，且最为常见。eBURST软件分析提示，有3个主要簇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和1个独立的不可分组的克隆群(两个分离物)存在。 Ⅰ类群包括整个微小脲原体分离株，而解脲脲原体(T960)分离株大部分分布在Ⅱ类和Ⅲ类群，但该研究未观察到ST与微生物耐药性之间的相关性。目前，解脲脲原体药物敏感性与MLST相关研究仍较少，需更多研究来支持。

6 结语

解脲脲原体耐药性研究对指导临床用药及减少耐药性发生有重要意义，但目前研究方法和检验手段仍较为传统、局限，研究方案也仅停留在对前人实验的重复。在完善耐药机制研究的基础上，如何实现对耐药株的快速鉴定，从而指导抗菌药物的合理选择等仍需进一步研究。